小分子伴侣GroEL（191-345）在E．coli中的表达及其培养条件的优化

小分子伴侣GroEL(191-345)是分子伴侣GroEL顶端区域氨基酸残基191-345的片断，它能显提高基因工程蛋白蝎毒Cn5、亲环蛋白A和吲哚3-甘油磷酸合成酶等的复性效率，具有广阔的应用前景．为制得大量的小分子伴侣进行蛋白质复性研究，本对其培养条件进行了优化．结果表明携带小分子伴侣基因的工程茵在含有无机盐和碳源的M9培养基中培养能够显提高小分子伴侣的表达量，在确定M9为基本培养基之后，对其主要成分进行了优化；同时，考察了发酵温度、供氧量、诱导条件对表达量的影响，将发酵产量提高到556．3mg／L．     

重组亲环蛋白A的可溶性表达

为获得高表达量的可溶亲环蛋白A(cyclophilin A,CypA),对重组CypA质粒表达和工程菌的培养过程进行研究.首先将pRSET-CypA质粒转入EscherichiacoliBL21菌株,获得表达CypA的重组工程菌;然后以2×YT为基本培养基,对培养基组成包括碳源、氮源和氨苄青霉素浓度进行优化,并考察接种量和诱导条件(诱导剂浓度、诱导时机、诱导后培养时间)等对目标蛋白表达量的影响.结果表明:通过控制培养温度和转速可大大减少CypA包涵体的量;以甘露醇为碳源能显著提高目标蛋白的表达量;优化的培养基组成为蛋白胨16 g?L-1,酵母提取物10 g?L-1,NaCl 5 g?L-1,甘露醇10 g?L-1,Amp50 mg?L-1;在对数生长期中期OD600为1.3时加入1 mmol?L-1IPTG诱导,然后在30℃、180 r?min-1条件下继续培养9 h收获菌体;优化后目标蛋白CypA产量为66.7 mg?L-1发酵液,与优化前相比提高了76.6%.     

大丽轮枝菌拮抗细菌多粘芽孢杆菌7-4菌株发酵产抗菌蛋白条件的优化

为了提高大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)拮抗细菌多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)7-4菌株的发酵产抗菌蛋白量,采用单因素法对B.polymyxa7-4菌株发酵培养基所需的碳源、氮源、无机盐进行了筛选,并采用正交试验与单因素试验对7-4号菌株的发酵培养基组成及培养条件进行了优化,最终确定最适发酵培养基及培养条件为:葡萄糖5.0%,大豆蛋白胨5.0%,MnSO40.02%,MgSO4.7H2O 0.10%,培养基初始pH 7.5,种龄10~12 h,30℃摇床培养48 h。经过优化抑菌圈直径增加了50.4%。     

重组牛凝血酶原-2在大肠杆菌中的表达及包涵体的制备

将含凝血酶原-2的质粒成功地转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导培养,获得凝血酶原-2包涵体.经对培养基成分及操作条件进行优化,详细考察了碳源、氮源、无机盐、诱导起始时间、诱导剂添加量、接种量、发酵温度和转速等因素对目标蛋白表达量的影响.在优化的条件下,重组凝血酶原-2包涵体的产量为110 mg/L发酵液,占菌体总蛋白的21.7%.     

抗呋喃唑酮代谢物衍生物单链抗体-AP酶融合蛋白表达条件优化

为提高抗呋喃唑酮代谢物衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。采用液体培养基发酵培养能表达出目的蛋白的基因工程菌,对诱导表达得到的目标融合蛋白进行鉴定,探讨5种培养基、6种诱导时间和4种诱导剂-异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度对融合蛋白表达的影响,再通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基琼脂糖凝胶柱和直接竞争酶联免疫分析法进行纯化并对其活性进行鉴定。结果表明,最适宜条件为SB培养基,诱导剂IPTG浓度为0.6 mmol/L,培养9 h,该条件下抗呋喃唑酮代谢物衍生物单链抗体-AP融合蛋白的表达效果较好,表达量从2.89%增加到5.75%,总体增加了约2.86百分点,通过NHS活化羧基琼脂糖凝胶柱纯化后融合蛋白的浓度为1.973 mg/mL,IC₅₀值为56.923 1 ng/mL。本试验单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达量得到了很好的提高,并获得生物活性较好的融合蛋白,为后续呋喃唑酮代谢物免疫检测分析方法的建立奠定了一定基础。     

昆虫病原细菌Cip蛋白基因工程菌发酵条件的优化

昆虫病原发光杆菌属(Photorhabdus)细菌产生的2种胞内晶体蛋白CipA和CipB已在大肠杆菌原核表达系统中进行稳定表达,为进一步提高该蛋白在大肠杆菌中的表达水平,确定工程菌摇瓶培养的最适条件,研究了多种无机离子、装液量、培养基初始pH值、诱导前添加葡萄糖等因素对工程菌摇瓶发酵的影响。结果显示,在发酵培养基中添加10 mmoL/L Mg2+和15 mmoL/LPO43-,调节初始pH值至7.2,装液量为25mL(250mL摇瓶),诱导前添加10g/L葡萄糖时,Cip蛋白的表达量可明显提高,发酵条件优化后CipA和CipB的表达量达到了39%和41%。     

乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的工艺优化

[目的]提高乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的水平.[方法]对培养基种类、接种量、培养温度、诱导剂浓度、磷酸甘油二钠浓度等因素进行了优化.[结果]使用DifcoTM M17 Broth培养基培养乳酸乳球菌时,L-苯丙氨酸解氨酶表达活性最高;磷酸甘油二钠对L-苯丙氨酸解氨酶表达活性有较大影响,可提高活性93.8％.通过正交试验,得到PAL最佳表达条件为接种量2.0％,培养温度30℃,磷酸甘油二钠浓度2.0％,诱导剂浓度10.0 μg/L. PAL表达酶活可达3.05 IU/ml.[结论]在发酵扩大培养中优化了L-苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球菌中的表达条件,为今后生产及应用提供参考.     

培养条件对pTrxAR质粒在E.coliGI724中孕育量的影响

硫氧还融合表达系统是Invitrogon公司近年来发展的以E .coli硫氧还蛋白作为融合伴侣的融合表达系统。其重组质粒的诱导表达需在E .coliGI系列菌株中进行。本文对载体质粒pTrxFus及其携带编码hARLBD基因的重组质粒pTrxAR在E .coliG1 72 4株中的质粒孕育量与生长培养条件的关系进行了研究。结果表明 ,菌株在平板RM培养基上的活化生长时间及菌体液体培养时的温度对其质粒孕育量影响极大 ,其次为液体培养基中Ampicillin浓度。菌体在35℃ ,1 0 0ug/mlTrp的诱导条件下 ,其重组质粒在数小时内迅速丢失。通过菌体质粒的提取、测定 ,可为优化使用该表达体系表达hARLBD片段的表达条件提供理论指导。     

毕赤酵母表达MSL的发酵条件研究

本试验对含有pPIC9K-MSL转化子的毕赤酵母在BSM基础盐培养基中发酵培养条件进行了研究,并从BSM基础盐培养基组分、补料方式以及诱导时间对酵母生长发酵和表达高浓度的外源蛋白的影响进行了单因素优化试验,得到了毕赤酵母在BSM基础盐中发酵MSL的生产工艺。     

抗犊牛腹泻益生菌株BN-9产芽孢条件的优化

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BN-9菌株是一株能够抑制犊牛腹泻病原菌大肠杆菌(Escherichia coli)的益生菌.为提高该菌株的芽孢生成率,对其产芽孢条件进行了优化.采用单因素试验方法,选择益生菌BN-9菌株的适宜碳源、氯源、无机盐;采用正交设计,结合SPSS软件进行分析,优化出BN-9菌株的最适宜的发酵培养基组成和发酵产芽孢条件.BN-9菌株的芽孢生成率最高时,其相应的培养基组成及发酵条件如下:蔗糖为0.25%,黄豆粕粉为1.5%,MgC12为0.01%,MnSO4为0.01%,种龄12 h,接种量4%,装瓶量100 mL·250 mL-1,培养基初始pH 8.0,摇床转速200 r·min-1.37℃发酵培养48h.通过研究,确定了BN-9菌株芽孢生成率最高时的培养基组成和发酵条件;优化后,BN-9菌株的芽孢生成率提高到93.83%.相应的细菌数为2.28x108cfu·mL-1.     

人基质蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域原核表达优化

用构建的人基质蛋白酶-2（MMP-2）类血红素结构域原核表达载体PET25b—PEX转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性菌落LB液体培养基培养，异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达产生的表达蛋白，大小约29kD，与预期大小相符。设置不同的IPTG诱导终浓度，诱导时间，诱导时菌液OD值和LB液体培养基的pH值，SDS-PAGE电泳和软件分析发现，当IPTG浓度为0．7mmol／L，诱导4h，诱导时菌液OD值为0．7时，实验能获得最高的PEX蛋白表达；5L大规模培养时，LB培养基pH值为7．5时，可获得较高的重组PEX蛋白表达。     

人TRIM5α嵌合体在大肠杆菌中的优化表达

应用SDS-PAGE电泳检测方法,研究了本实验室构建的人TRIM5α嵌合体重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件。结果表明:在31℃、IPTG的诱导浓度为0.5 mmol/L、诱导时长为8 h、菌液的OD值为0.6以及在TB培养基上培养条件下人TRIM5α嵌合体蛋白表达量达到最大。     

峨眉含笑精油抑菌作用研究

[目的]为城市森林生态保健型绿化模式树种的选择及配置提供科学依据。[方法]用水蒸气蒸馏法提取峨眉含笑精油,以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为供试菌种,通过贴滤纸片法测试峨眉含笑精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用。[结果]峨眉含笑精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用。浓度为20%的峨眉含笑精油对大肠杆菌的抑制效果最为明显,其抑菌斑为3.3 cm。浓度为30%的峨眉含笑精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果极显著差异于其他浓度(P<0.01),其抑菌斑为3.57 cm。[结论]峨眉含笑植物精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最佳抑菌浓度分别为20%和30%。峨眉含笑是城市森林生态保健型绿化模式应选择的适宜树种。     

大熊猫源石膏样小孢子菌培养条件的筛选

为探明大熊猫源石膏样小孢子菌的最佳培养条件,在不同培养基、碳源、氮源、温度、pH等条件下培养石膏样小孢子菌,用十字交叉法测量菌落每天的生长情况。结果显示,石膏样小孢子菌在沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上生长最好,在改良沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、高盐培养基上均生长良好,但在皮肤癣菌鉴定培养基和子囊孢子培养基上生长缓慢;5种碳源对菌株生长的影响不大,其中葡萄糖使该菌生长较好;在5种氮源培养基中,除了在以尿素为氮源的培养基中该菌株不能生长外,在以蛋白胨、硝酸钠、草酸铵、硫酸铵为碳源的培养基中该菌均能生长,且在以蛋白胨为氮源的培养基中生长最好;该菌株生长的最适培养温度为25℃,在15~35℃均可生长,在35℃时生长最差;在pH值为10时生长最好,在pH值为5、6、8、9时均能够良好生长,比在pH值为7时的生长更好,在pH值为4、11时的生长较差。     

基于葵花杆硫酸铵生物基肥的番茄不同生育期配方肥的效果

有机水溶肥能有效促进作物生长和改良作物特性。针对番茄不同生育期需肥特性不同,本试验以生物基磺酸盐为基础,设计苗期、花期、结果期配方肥,苗期N₂O+P₂O₅+K₂O总量为22,设置E1(12-4-6)、E2(9-4-9)两个N-P-K水平;开花期N₂O+P₂O₅+K₂O总量为50,设置M1(20-8-22)、M2(19-6-25)两个N-P-K水平;膨果期N₂O+P₂O₅+K₂O总量为58,设置L1(15-9-34)、L2(13-7-38)两个N-P-K水平,共8个处理,系统研究其对番茄植株长势、果实品质与产量以及土壤养分的影响,以筛选出能有效提高番茄品质、产量及有效改良土壤养分的配方肥。结果表明,番茄生长前期N-P-K为12-4-6和9-4-9时对植株生长无显著影响;生长中期N-P-K为20-8-22时比19-6-25有利于株高、茎粗、叶片数的增加;生长后期N-P-K为20-8-22(M1)13-7-38(L2)有利于提高茎粗、叶片数、叶绿素含量。E1M2L1和E2M1L2可溶性糖含量最大为5.71%、5.70%,E1M1L1显著低于E1M2L1;E2M1L2可溶性固形物含量最高,较E2M2L2高9.1%;E1M2L2的V_C含量最高,E2M1L1、E2M1L2和E2M2L1次之。E1M1L2显著增加了番茄产量,比E2M2L2最低产量高88.2%,E1M2L1和E2M1L2次之,667 m²产量分别达3 748.60、3 347.81 kg。E2M1L2速效养分含量、EC、pH均表现居中。从产量而言,E1M1L2能够显著增加番茄产量,增加经济效益,但通过主成分分析表明,E2M1L2即苗期总肥量为22,N∶P∶K为9∶4∶9,开花期总肥量为50,N∶P∶K为20∶8∶22,膨果期总肥量为58,N∶P∶K为13∶7∶38更有利于番茄生长,果实品质和土壤质量的提高。     

Establishment and Optimization of the Regeneration System of Mature Embryos of Maize (Zea mays L.)

A reliable system was developed for regeneration from mature embryos derived from callus of four maize inbred lines (Liao 7980,Dan 9818,Dan 340,and Dan 5026).The protocol was mainly based on a series of experiments involving the composition of culture medium.We found that 9 μM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in MS medium was optimum for the induction of callus.The induction frequency of primary calli was over 85% for four inbred lines tested.The addition of L-proline (12 mM) in subculture medium significantly promoted the formation of embryogenic callus but it did not significantly enhance growth rate of callus.Efficient shoot regeneration was obtained on regeneration medium containing 2.22 μM 6-benzylaminopurine in combinations with 4.64 μM Kinetin.Regenerated shoots were rooted on half-strength MS medium containing 2.85 μM indole-3-butyric acid.This plant regeneration system provides a foundation for genetic transformation of maize.     

rhtB基因过表达苏氨酸工程菌发酵过程的优化控制

[目的]构建了负责运输苏氨酸至胞外的转运蛋白的关键基因rhtB过表达的苏氨酸发酵菌M122,考察不同的碳源、氮源及pH对该重组菌产L-苏氨酸的影响。[方法]选用不同的碳、氮源对L-苏氨酸生产菌株的发酵过程进行分析,对发酵培养基的碳、氮源及pH进行优化。[结果]定向改造后苏氨酸发酵菌对营养物质的利用效率增加,使用蔗糖作为碳源发酵时,摇床培养L-苏氨酸产量为28.1 g/L;以（NH4）2SO4或酵母粉作为氮源发酵时,L-苏氨酸产量分别为27.8和28.2 g/L,均优于使用其他氮源时苏氨酸的产量。对发酵的最适pH研究表明,中性条件下更有利于菌体的生长和L-苏氨酸的产生。[结论]确定了苏氨酸发酵菌M122的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为（NH4）2SO4或酵母粉,最适pH为7.0。     

巯基乙醇在家蝇幼虫血淋巴中适宜添加量研究

[目的]为家蝇幼虫血淋巴抗菌活性物质的分离、纯化提供依据。[方法]以大肠杆菌为指示菌,利用琼脂糖孔穴扩散法研究巯基乙醇对家蝇幼虫血淋巴抑菌活性的影响,确定巯基乙醇作为抗氧化剂在家蝇幼虫血淋巴中的适宜添加量。[结果]巯基乙醇能抑制大肠杆菌的生长,抑菌效果随其浓度的增加更为明显。当巯基乙醇体积浓度≤10-6时,其对大肠杆菌无抑菌效果,说明巯基乙醇的最大非抑菌体积浓度为10-6。体积浓度为10-6的巯基乙醇可有效保护浓度小于或等于1∶5的家蝇幼虫血淋巴悬液不被氧化,且其对大肠杆菌的抑菌效果不受影响。[结论]巯基乙醇在家蝇幼虫血淋巴中的适宜加入量应根据试验中具体情况确定。     

春秋两季不同地区猪源耐药大肠杆菌β-内酰胺酶及16SrRNA甲基化酶基因检测及分析

为了解新疆春秋两季不同地区耐药猪源大肠杆菌携带β-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因及其共存情况。通过PCR方法对克拉玛依地区142株春季猪源耐药菌、9株克拉玛依秋季猪源耐药菌、78株昌吉地区春季猪源耐药菌和52株昌吉地区秋季猪源耐药菌进行β-内酰胺酶(blaTEM、blaCMY-2、blaLAP-1、blaKPC、blaSHV和blaOXA)和16S rRNA甲基化酶(arm A和rmt B)基因检测,并对检出耐药基因的PCR产物进行测序。结果显示:克拉玛依春季猪源耐药菌携带的β-内酰胺酶基因为blaTEM(142/142,100%)、blaOXA(16/142,11.3%)、blaCMY-2(7/142,4.9%)和blaLAP-1(1/142,0.7%);克拉玛依秋季猪源耐药菌携带的β-内酰胺酶为blaTEM(9/9,100%)和blaOXA(1/9,11.1%),克拉玛依春秋两季猪源耐药菌均未检测出16S rRNA甲基化酶基因;昌吉地区春季猪源耐药菌携带的β-内酰胺酶基因为blaTEM(78/78,100%)、blaOXA(9/78,11.5%)、blaCMY-2(3/78,3.8%)和16S rRNA甲基化酶基因rmt B(1/78,1.3%);昌吉地区秋季猪源耐药菌携带的β-内酰胺酶基因为blaTEM(52/52,100%)、blaOXA(4/52,7.7%)、blaCMY-2(3/52,5.8%)和blaSHV(1/52,1.9%),未检测出16S rRNA甲基化酶基因。上述结果表明春秋两季不同地区猪源大肠杆菌blaTEM检出率均为100%;其次不同地区春季猪源大肠杆菌对blaOXA检出率均高于秋季猪源大肠杆菌。产生β-内酰胺酶及16S rRNA甲基化酶基因是猪源菌对β-内酰胺类及氨基糖苷类抗菌药物耐药的主要原因之一,养殖场应合理使用抗菌药物,加强对产生β-内酰胺酶及16S rRNA甲基化酶基因的监控。     

健康鸡猪体内大肠杆菌对四环素的耐药性及耐药基因分布

【目的】四环素作为人类和动物临床上广泛使用的广谱抗生素,其耐药性问题一直为全球所关注。健康动物体内的共生性大肠杆菌作为耐药指示菌和耐药基因的贮存库,了解其对四环素的耐药性及耐药机制对于疾病的防控具有重要意义。【方法】从健康鸡、猪体内分离大肠杆菌,用微量肉汤法检测其对四环素的耐药性,并用PCR方法对耐药菌株中8种四环素耐药基因的携带情况进行调查,运用统计学方法分析鸡、猪体内大肠杆菌分离株的耐药性和耐药基因分布情况的差异。【结果】总共分离鉴定出大肠杆菌269株,其中86.2%的菌株对四环素产生了耐药性,健康猪体内大肠杆菌分离株的耐药性明显高于健康鸡体内分离株(P0.05)。tet(A)、tet(B)和tet(M)3种四环素耐药基因广泛存在于健康鸡、猪体内的共生大肠杆菌中,所携带比例分别为87.9%、28.4%和15.5%;所有对四环素耐药的大肠杆菌均携带tet(A)或tet(B)基因,其中25.0%和2.6%的耐药菌株分别携带有2种和3种耐药基因,tet(M)基因与tet(A)或tet(A)+tet(B)基因共存于对四环素耐药的大肠杆菌中;健康鸡、猪体内耐药性大肠杆菌在tet(A)+tet(M)基因携带率方面的差异具有统计学意义(P0.01)。【结论】健康鸡、猪体内的大肠杆菌分离株普遍对四环素耐药,四环素耐药基因广泛分布于大肠杆菌分离株中,大肠杆菌对四环素的耐药机制以主动外排作用为主,核糖体保护基因在大肠杆菌对四环素耐药机制方面的作用尚待进一步的研究。