重组捻转血矛线虫半乳糖凝集素对山羊外周血单核细胞细胞因子mRNA转录的抑制作用

 【目的】以体外试验观察雌雄捻转血矛线虫半乳糖凝集素重组蛋白（rHco-gal-m/f）对山羊外周血单核细胞多种细胞因子mRNA转录水平的影响及其量效关系。【方法】选用2岁健康山羊5只，分别从颈静脉无菌采血，分离外周血单核细胞(PBMCs)，以ConA或LPS刺激的同时分别加入0 μg•ml-1，10 μg•ml-1、20 μg•ml-1和40μg•ml-1的rHco-gal-m/f，进行体外培养。用RT-PCR方法，以肌动蛋白基因（β-actin）作内标，定量分析单核淋巴细胞白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA丰度。【结果】重组雄性捻转血矛线虫半乳糖凝集素(rHco-gal-m)可以抑制上述细胞因子mRNA的转录，并呈现出明显的剂量依赖性；重组雌性捻转血矛线虫半乳糖凝集素(rHco-gal-f)可抑制IL-1β、IL-4、IFN-γ and TNF-α的转录，也呈现出明显的剂量依赖性。【结论】重组捻转血矛线虫半乳糖凝集素能降低多种细胞因子在体外的转录。     

重组捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素免疫山羊皱胃细胞因子表达定位

【目的】检测重组雌、雄捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素(rHco-GAL-f/m)免疫山羊皱胃转录细胞因子。【方法】用rHco-GAL-f/m免疫山羊,通过原位杂交法对阴性对照组(A)、攻虫对照组(B)、免疫攻虫组(C)和免疫不攻虫组(D)山羊皱胃中白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA转录进行定位,并对上述细胞因子阳性反应细胞数量进行分析。【结果】A组山羊皱胃组织中没有检测到细胞因子,其它3组仅在皱胃黏膜下层中检测到了上述细胞因子。B、C和D组间IL-4和IL-6阳性反应细胞数差异显著(P0.05),其中C组明显高于其它两组;B、C和D组间IL-1?、IL-2和TNF-α阳性反应细胞数差异显著(P0.05),其中D组明显高于其它两组;IFN-γ阳性反应细胞数在B组和C组之间差异不显著(P0.05),D组与B组和C组之间差异显著(P0.05),且明显高于其它两组。【结论】重组捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素能够诱导山羊皱胃局部免疫应答。     

山羊胎儿成纤维细胞的冷冻保存和体外培养

将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后者快 ,二者间差异显著 ;而在 - 2 0℃条件下只有一小部分细胞能够存活 ,与前两者相比差异极显著 ,说明 - 2 0℃不适合冷冻胎儿细胞。冷冻保护液中含有 10 0 m L / L二甲基亚砜 (DMSO)的保护效果明显好于 5 0 m L / L DMSO,二者间差异显著。用组织块法培养的细胞 ,在两种培养基 DMEM和 M199中添加 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 -巯基乙醇 (2 - Me) ,其组织块成活率及细胞生长速度均高于单纯添加 10 0 m L / LFBS,同时证明 DMEM和 M199都能用于胎儿成纤维细胞的体外培养。以 DMEM培养液为基础 ,分别添加 2mm ol/ L 2 - Me,5 m L / L FBS,10 0 m L / L FBS和 2 m mol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS对山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养 ,结果显示 ,细胞在 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS培养液中生长迅速 ,两者间无明显差异 ,2 - Me的存在促进了细胞的增殖 ;两者都与添加 2 m mol/ L 2 - Me组存在显著差异 ;添加 2 m mol/ L 2 - Me和 5m L / L FBS相     

磷酸二酯酶抑制剂对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

哺乳动物有腔卵泡中的卵母细胞在体外会自发恢复减数分裂,适当延迟减数分裂的自发恢复,能促进核与胞质成熟的同步化,有利于后续胚胎的发育。本试验研究了磷酸二酯酶3(PDE 3)特异性抑制剂milrinone对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。结果表明,milrinone抑制山羊卵母细胞体外成熟的时间为6 h,其最佳剂量为100μmol/L,经milrinone处理体外培养28 h成熟的山羊卵母细胞用于孤雌激活,能显著提高孤雌激活胚的卵裂率及囊胚率。说明成熟培养液中添加适当剂量的milrinone,能显著提高体外成熟的山羊卵母细胞的质量。     

体外培养的山羊乳腺上皮细胞形态研究

通过有效的细胞培养方法获得山羊乳腺上皮细胞系,对这些细胞形态进行光镜观察,结果发现,细胞可形成闭合型和开放型细胞群,闭合型细胞群边界清晰,细胞之间结合紧密;开放型细胞群边界不清,细胞相互分散存在于一局限的范围内。乳腺上皮细胞与成纤维细胞混生时分区生长,界线明显;细胞之间形成许多腔状结构。纯化的乳腺上皮细胞通过单细胞悬浮后传代,部分细胞形成岛屿状聚集,部分细胞以贴壁的自由单个细胞散在形式存在。上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状(称之为乳球体);乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片,呈蜂窝状;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚;部分细胞呈圆饼状,体积较大;出现部分长形细胞;部分细胞表面出现绒毛状突起;接触抑制的上皮细胞形态不均一。     

捻转血矛线虫GST耐药基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。     

徐淮山羊多能性转录因子mRNA制备及在成纤维细胞中的表达

【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的CDS片段,构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒,随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒,通过体外转录,获得该4种多能性转录因子的mRNA,并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT-PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码全序列,将该4种基因分别克隆到pMD19-T载体,构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒。然后将pcDNA3.0载体和pMD19-T重组载体双酶切后用T4连接酶连接,构建含有T7启动子的真核表达载体pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒。各重组质粒分别用限制性内切酶XhoI、XbaI单酶切,酶切后质粒模版按照体外转录试剂盒说明体外转录获得各多能性转录因子的mRNA,并对获得的mRNA进行检测,确定其稳定性和浓度。按照脂质体（体积）﹕mRNA（质量）为1﹕1的比例用脂质体2000转染。转染24 h后,利用Western blot技术、间接免疫荧光实验检测徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的mRNA在成纤维细胞中的表达。【结果】①克隆得到的徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码序列全长分别为1 083、962、1 434和1 320 bp,并经TA克隆测序验证,其CDS 序列与绵羊、人、牛和猪等的序列相似性在89%以上;②体外转录获得的4种多能性转录因子的mRNA经脂质体转染徐淮山羊成纤维细胞,在成纤维细胞中均定位于细胞核;③4种多能性转录因子的mRNA在徐淮山羊成纤维细胞中表达的蛋白与预期大小一致,分别为38、34、50和48 kd。【结论】成功克隆了徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因,该4种多能性转录因子的mRNA能够在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达,为进一步研究Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的功能和山羊体细胞的重编程奠定基础。     

ROS对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

【目的】研究周期依赖性蛋白激酶抑制剂(Roscovitine,ROS)对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。【方法】将山羊卵母细胞置于含不同浓度(0(对照),20,40,80,120,160,200μmol/L)ROS的成熟液中培养24h统计第一极体排出率,初步筛选山羊卵母细胞成熟培养液中添加ROS的有效浓度;将山羊卵母细胞在含不同浓度(0(对照),40,80,120,160,200μmol/L)ROS的抑制培养液中培养8或16h,再转入常规培养液中培养至24h,统计第一极体排出率,确定ROS适宜的浓度和作用时间。将卵母细胞放入添加40μmol/L ROS的培养液微滴中进行抑制培养,抑制培养8h后分别再常规培养0,2,4,6,8,10,12,14,16h,统计各处理第一极体排出率。将山羊卵母细胞在最佳ROS处理方案下抑制培养后进行孤雌激活,观察孤雌胚的发育情况。【结果】成熟培养液中加入40μmol/LROS抑制培养山羊卵母细胞8h后再转入常规培养液中培养至24h,是比较理想的ROS处理方案。山羊卵母细胞成熟培养的16h以前,全程抑制和抑制8h再常规培养2个试验组第一极体排出率与常规对照组无显著差异;分别培养18,20,22h时,2个试验组第一极体排出率均极显著低于对照组;24h时,抑制8h再常规培养组第一极体排出率(58.76%)与对照组(63.13%)接近,无显著差异。试验组成熟卵母细胞孤雌激活胚的囊胚率(46.75%)显著高于对照组(36.04%,P<0.05)。【结论】山羊COCs成熟培养液中加入40μmol/L ROS培养8h再转入常规培养液培养至24h,是山羊卵母细胞核质同步成熟较适宜的方案,此方案可以有效抑制18～22h核成熟卵母细胞的减数分裂恢复,推迟4～6h成熟,达到培养24h核质同步成熟的目的,提高了体外培养卵母细胞的质量。     

一种有效分离及在体外扩增成年小鼠精原干细胞的方法

尝试建立一种简便有效的成年小鼠精原干细胞分离培养及扩增的方法。从单只成年小鼠的睾丸中经过两步酶消化法分离精原干细胞,并在去除间质细胞、纯化后的支持细胞饲养层上培养与扩增,获得稳定增殖的精原干细胞系。此方法可显著提高建系成功率,保证细胞系的单一基因型,显著降低体外培养精原干细胞的成本。为成体基因来源的转基因动物的制作和疾病模型的建立提供技术支持。     

小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养

为了探讨小鼠卵巢颗粒细胞体外生长的特点及增殖的调控因素,分别添加2μg/mL胰岛素、50ng/mL FSH和20 ng/mL EGF的培养液培养小鼠卵巢颗粒细胞,每隔24 h对细胞进行计数,研究其对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。此外,还对培养过程中出现的卵巢颗粒细胞集落进行了AKP染色和C-kit免疫组化染色鉴定。结果显示,在培养的第4天添加EGF组和FSH组与对照组相比均具有显著的促增殖作用(P<0.05),添加胰岛素组促增殖作用不显著(P>0.05);卵巢颗粒细胞集落经AKP染色和C-kit免疫组化染色均呈阳性。提示EGF和FSH对小鼠卵巢颗粒细胞具有促增殖效应,小鼠卵巢颗粒细胞具有干细胞的部分特性。     

3种杀菌剂对小麦黑胚病菌的毒力测定及病害防治作用

采用分生孢子萌发率和菌落直径比较了3种杀菌剂对小麦黑胚病主要致病菌小麦根腐离蠕孢(B ip olaris sorok injana)和链格孢霉(A lternaria a lterna ta)的毒力作用,并在温室盆载和田间小区试验条件下进行了防治效果研究。结果表明,不同杀菌剂、同种杀菌剂不同浓度之间存在明显毒力差异。从分生孢子萌发率看,敌力脱浓度为0.250μL/mL时对小麦黑胚病2种病原菌分生孢子萌发抑制率高达99%以上,代森锰锌浓度为350μg/mL时的抑制率达94.5%以上,而多菌灵浓度为500μg/mL时的抑制率不到40%,远远低于以上两种药剂。从菌落直径看,敌力脱的致死中浓度(EC50)值最小,对小麦黑胚病菌菌丝生长的抑制作用最强。在小麦灌浆初期对温室盆栽和田间小区种植的感病品种丰舞981于人工接种前2 d和接种后4 d分别喷施3种杀菌剂,小麦黑胚率调查结果与室内抑菌实验结果相似,敌力脱和代森猛锌对小麦黑胚率有较好的控制作用,而多菌灵效果较差。接种病原菌后4 d喷药处理的防病效果明显优于接种前2 d的喷药处理。     

三角帆蚌IGF2基因的亚细胞定位及重组蛋白促体外细胞活性分析

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factors 2, IGF2)在多种细胞生长、分化和合成代谢的调节中发挥重要的调控作用。本研究成功构建了淡水珍珠贝三角帆蚌IGF2的重组质粒pEGFP-IGF2和pET32a-IGF2,通过pEGFP-IGF2-细胞转染,表明该蛋白定位在细胞质与细胞核中。将pET32a-IGF2转化到BL21 (DE3)中进行蛋白诱导表达,成功得到其原核表达载体,SDS-PAGE检测显示,在约25kD处有一条清晰的条带,符合目的条带大小（26.27kD）,且主要表达于上清液中。为研究重组蛋白IGF2对三角帆蚌细胞活性的作用,本研究通过CCK8细胞活性测定,进一步探讨了添加不同浓度重组目的蛋白（0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、7.5 μg/mL、 12.5 μg/mL、17.5 μg/mL、 22.5 μg/mL）培养的三角帆蚌外套膜细胞增殖活性。结果显示,三角帆蚌IGF2重组蛋白能显著促进三角帆蚌外套膜细胞的增殖活力（P＜0.05）,且在其浓度为12.5 μg/mL时对三角帆蚌外套膜细胞的促生长效果最佳,这为促进三角帆蚌外套膜细胞传代、细胞系建立奠定了基础,也为下一步探究IGF2在贝类中的功能提供依据。     

PCV2和猪伪狂犬病弱毒疫苗体外共接种对猪PBMC中IL-2及IL-6 mRNA表达的影响

将猪圆环病毒2型（PCV2）与猪伪狂犬病弱毒疫苗（PRV）体外单接种和共接种仔猪外周血单个核细胞（PB-MC）,采用real-time PCR技术定量检测接种后不同时间PBMC细胞因子IL-2和IL-6的mRNA表达水平,以分析PCV2对PRV免疫反应的影响。结果显示,PRV接种组PBMC中IL-2与IL-6的mRNA表达均出现显著上调（P〈0.05）,PCV2接种组IL-2与IL-6的mRNA表达在接种后的部分时间也出现显著上调,但PCV2与PRV共接种组的IL-2与IL-6的mRNA表达较PRV组均出现显著下调,表明PCV2能够抑制PRV促进猪PBMC中IL-2与IL-6的mRNA表达上调作用,提示PCV2可能会对PRV的免疫反应产生不利影响。     

Immune BlotAnalysis on Expression of the Mammalian Target of Rapamycin in Goat Fetal Fibroblasts with Recombinant Polyclonal Antibody

To detect the mammalian target of rapamycin (mTOR) expressed in Cashmere goat fetal fibroblasts (GFb), mTOR gene was cloned from Inner Mongolia Cashmere goat (Capra hircus) and expressed in Escherichia coli followed by immunizing mice with the purified recombinant protein as an immunogen to produce the anti-goat mTOR recombinant polyclonal antibody. Antiserum was collected from the immunized mice after the fifth immunization and its titer was determined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the recombinant polyclonal antibody had a titer 1:200 000 and could react with the mTOR expressed in GFb cells with a specific and sensitive affinity. Western blot showed that mTOR expression and phospho-mTOR (Ser 2448) activity were inhibited when GFb cells were treated with CCI-779, an mTOR specific inhibitor.     

人类原始生殖细胞的体外培养

为了探讨人原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层,室温下用1．25 g／L胰蛋白酶+0．2 g／L EDTA消化人胚胎组织5～9 min,或用1 g／L胶原酶(IV型)消化20～40 min,分离得到PGCs,然后用不同培养液培养,从培养液角度较为系统的研究原代培养人原始生殖细胞的条件。结果表明,在KSR培养液(体积分数15％ Knockout serum replacement+高糖DMEM+10 ng／mL人重组白血病抑制因子(LIF)+4 ng／mL人重组碱性成纤维细胞生长因子+10 ng／mL Forskolin)和STO(建系的小鼠胚胎成纤维细胞)条件培养液中培养的原代人原始生殖细胞,有较高的克隆形成率;培养液中添加不同质量浓度的LIF对克隆形成率影响差异不大。     

地锦草体外抑菌有效部位的筛选试验

采用水煎、水醇和五部位提取法从地锦草中提得组成成分不同的７ 种提取物,以肠道致病性大肠杆菌Ｏ７８∶Ｋ８０,沙门氏菌Ｃ７９－１,金黄色葡萄球菌为目的菌株进行体外抑菌试验。结果表明,水煎提取物对大肠杆菌Ｏ７８∶Ｋ８０,沙门氏菌Ｃ７９－１,金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度分别为１０,１０,１２．５ ｇ／Ｌ;水醇提取物对上述试验菌的最小抑菌质量浓度依次为５,７．５,１０ ｇ／Ｌ;五部位法所得５ 种提取物的抑菌浓度均大于１５ ｇ／Ｌ     

紫锥菊提取物对奶牛外周血单核细胞增殖的影响

[目的]为合理开发利用紫锥菊产品提供理论依据。[方法]以早期妊娠的荷斯坦奶牛为试验动物,采用ELISA方法检测不同浓度狭叶紫锥菊提取物（Polinacea^TM）（6.3、20.0、60.0、180.0μg/ml）体外结合刀豆蛋白A（ConA,1μg/ml）和美洲商陆有丝分裂原（PWM,0.6μg/ml）对其外周血单核细胞（PBMC）增殖的影响。[结果]不同浓度Polinacea^TM均能促进正常奶牛PBMC增殖,180.0、6.3μg/ml Polinacea^TM刺激PBMC增殖的结果分别较对照高了近10和2倍;不同浓度Polinacea^TM结合ConA均可抑制PBMC增殖,其中180.0μg/ml Polinacea^TM结合ConA对PBMC增殖具有显著抑制作用;20.0、60.0μg/ml Polinacea^TM结合PWM可显著刺激PBMC增殖。[结论]紫锥菊提取物对奶牛外周血单核细胞增殖的影响具有剂量依赖性。     

杜梨组培苗两步生根技术体系优化

为解决杜梨组培苗生根率低和移栽成活率低的问题,本研究以杜梨组培苗为试材,通过不定根诱导、不定根生长培养和试管苗驯化移栽环节,筛选出最适杜梨组培苗生长的培养基配方和炼苗方式。结果表明:1)健壮组培苗在添加了1.0 mg/L吲哚乙酸(IAA)和1.0 mg/L萘乙酸(NAA)的NN₆₉(Nitsch & Nitsch Medium)培养基中暗培养7 d后进行不定根诱导,再转接至无生长素类物质的相同培养基中光照培养,组培苗生根率达96%;2)生根组培苗闭瓶炼苗和水培炼苗3周后移栽,成活率均达90%以上。综上所述,前期“高浓度生长素和黑暗培养”和后期“无激素和光照培养”的“两步生根法”适宜杜梨组培苗的生根诱导。杜梨组培苗生根技术的优化,为杜梨无性系砧木的商业化生产提供了技术支持。     

重组鸡α-干扰素对鸡外周血T淋巴细胞亚类的影响

重组鸡α-干扰素(rChIFN-α)静脉注射4~6周龄SPF鸡,24 h后采血分离淋巴细胞,通过流式细胞术测定不同时间外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞的百分率。结果显示,rChIFN-α可以在48~72 h内明显提高CD4+T淋巴细胞的百分率,并下调CD8+T淋巴细胞的百分率,证明rChIFN-α具有显著的免疫调节作用。