基因佐剂CpGDNA对生长抑素DNA疫苗pES/2SS的作用

 【目的】探讨CpGDNA对生长抑素DNA疫苗免疫小鼠免疫效果的影响。【方法】生长抑素质粒pES/2SS分别与CpG-ODN、pE-CpG、细菌DNA、脂质体配合免疫小鼠，疫苗剂量为20μg/只，佐剂等量混合，2周后加强免疫。【结果】雌性小鼠免疫后4、6周，疫苗组平均增重显著高于对照组(P<0.05)。CpGDNA和DNA疫苗联合免疫后SS抗体P/N值、IgG2a/IgG1、脾细胞活性、GH和IGF-I均比单一使用DNA疫苗的高(P<0.05)。免疫后4周，P/N值以pES/2SS + CpGODN组最高，SI值以pES/2SS+ CpG-ODN组最高。CpGDNA佐剂组GH从第2周开始升高，至第6周达高峰，显著高于pES/2SS组（P<0.01），CpG-ODN组GH高水平持续时间最长，至免疫后8周，仍显著高于pES/2SS组（P<0.01）。CpGDNA组IGF-I值显著高于pES/2SS疫苗组（P<0.05）。【结论】生长抑素基因免疫小鼠可以产生SS抗体，而含CpGDNA序列的核酸佐剂及脂质体粗品，可以增强生长抑素基因疫苗的效果。     

小鼠对pGM-CSF/SS生长抑素基因疫苗的免疫应答

通过研究细胞因子GM-CSF与生长抑素pcS/2SS融合表达质粒pGM-CSF/SS诱导小鼠免疫应答的影响,探求生长抑素基因免疫新策略。将60只20日龄雄性昆明小白鼠均分为6组,分别用PBS(C0)、pGM-CSF质粒(C1)、pGM-CSF/SS质粒(T1、T2、T3)、pcS/2SS(T4)质粒口服免疫,T1~T4组的免疫剂量分别为2×106cfu/mL、2×108cfu/mL、2×1010cfu/mL、2×108cfu/mL,以上质粒均以减毒沙门氏菌为传导载体。结果显示:pGM-CSF/SS组的抗生长抑素抗体AP/AN值显著高于pcS/2SS组,阳性鼠体增重亦高于pcS/2SS组,抗体阳性率分别是71.4%和40.0%。另外,高剂量组的AP/AN值极显著高于低剂量组,显著高于中剂量组;中剂量组的AP/AN值显著高于低剂量组,高剂量组的抗体阳性率也明显高于中剂量组和低剂量组,分别为100%、71.4%和20.0%。可见,pGM-CSF/SS疫苗的免疫效果优于pcS/2SS疫苗,且pGM-CSF/SS疫苗呈剂量依赖关系。这些结果显示出细胞因子GM-CSF可以增强生长抑素DNA疫苗的免疫效果。     

CpG DNA对鸡传染性喉气管炎病毒DNA疫苗免疫效果的影响

 将分别构建的含有鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）王岗株ｇＢｇＣ和ｇＤ基因的重组真核表达质粒及ＣＰＧＤＮＡ佐剂分组肌肉注射 ＳＰＦ鸡，检测了免疫后的抗体水平，并观测了攻毒后的免疫保护效果。实验结果显示，ＣｐＧＤＮＡ佐剂和ＤＮＡ疫苗联合免疫后的抗体水平比单一使用ＤＮＡ疫苗的要高，而佐剂组的发病率、死亡率均低于非佐剂组，保护率则高于非佐剂组。这表明 ＣｐＧ ＤＮＡ佐剂增强了 ＩＬＴＶ ＤＮＡ疫苗的免疫效果。     

DNA疫苗研究进展

DNA疫苗的研究已成为疫苗研究领域的热点,被称为疫苗的第3次革命.分析了DNA疫苗的优缺点、免疫机制、优化策略等.     

GM-CSF与生长抑素共表达基因疫苗的构建和鉴定

以基因疫苗pVGS/2SS-asd为模板,采用分子生物学方法,分别获得目的片段粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（ GM-CSF）和含有乙肝表面抗原S基因的生长抑素基因（ SS）。以共表达质粒pIRES为载体,采用基因工程方法,将GM-CSF和SS基因片段分别克隆到载体的多克隆位点A和多克隆位点B上,构建共表达基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS,旨在同时表达GM-CSF和SS两种蛋白。获得表达质粒后,酶切和测序鉴定该共表达基因疫苗,结果显示,该共表达基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS构建成功,为该共表达基因疫苗的后续研究奠定了良好的基础。     

生长抑素DNA疫苗对湖羊羔羊生长和相关激素的作用——佐剂效应

选择60只断奶湖羊母羔羊,分为6组,1～5组为免疫组,分别用pES/2SS pE-CpG、pES/2SS 细菌DNA、pES/2SS-GMCSF、pES/2SS脂质体和pES/2SS免疫,第6组为对照组.结果显示,首次免疫4周和加强免疫2周后,细菌DNA佐剂组的抗生长抑素抗体水平显著高于pES/2SS单独免疫组(P＜0.05),其抗体阳性率也最高,达50%.比较全期14周免疫羊的体质量增加情况,最优为pE-CpG佐剂组,其次为细菌DNA佐剂组,分别比对照组高33.0%和31.6%(P＜0.01),且显著高于pES/2SS单独免疫组(P＜0.05).加强免疫2周后,免疫组GH和IGF-Ⅰ水平显著高于对照组(P＜0.05),抗体阳性羊的GH和IGF-Ⅰ水平极显著高于抗体阴性羊(P＜0.01).结果表明:几种佐剂配合pES/2SS免疫,产生了免疫佐剂效应,能增强生长抑素DNA疫苗的免疫效果.     

左旋咪唑对金黄色葡萄球菌粘附素 ClfA重组 DNA 疫苗免疫效果的影响

为了探究左旋咪唑（LMS）作为免疫增强剂对金黄色葡萄球菌粘附素 ClfA 重组 DNA 疫苗免疫效果的影响.分别用含左旋咪唑的 ClfA 重组 DNA 疫苗、ClfA 重组 DNA 疫苗及空载体免疫昆明白小鼠,通过巨噬细胞吞噬试验、MTT 实验、免疫血清对金黄色葡萄球菌识别能力、酶联免疫吸附试验和攻毒试验验证免疫效果.结果表明,含左旋咪唑 DNA 疫苗组在巨噬细胞吞噬指数、脾脏淋巴细胞增殖、免疫血清对金黄色葡萄球菌识别能力方面有增强作用,与其他两组相比差异显著（P ＜0．05）,含左旋咪唑 DNA 疫苗组小鼠抗体水平及攻毒实验保护率高于单独 ClfA 重组 DNA 组和空载对照组,LMS 能够对 ClfA 重组 DNA 疫苗免疫效果起到增强作用.     

猪瘟病毒E2基因DNA疫苗的试验研究

用构建的E2-pcDNA4.0 DNA疫苗对Balb/c小鼠、家兔和仔猪进行免疫,经3次肌肉接种,间隔15 d免疫后,测定抗体水平.结果表明,构建的DNA疫苗能诱导小鼠产生中和性抗体,免疫家兔最少可抵抗10个最小感染剂量(M ID)的猪瘟兔化弱毒苗的攻击.攻毒试验结果表明,E2-pcDNA4.0 DNA疫苗可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击.     

生长抑素基因疫苗对肉用鸡血浆生化指标和免疫器官指数的影响

研究以减毒沙门氏菌为载体的生长抑素基因疫苗对肉鸡的血浆生化指标和免疫器官指数的影响。将28日龄的150只肉鸡随机分为5个组,每组30只,A、B、C组口服生长抑素基因疫苗,剂量分别为8×109CFU/只、4×109CFU/只、1×109CFU/只,D组口服生理盐水,作为对照组,E组口服减毒沙门氏菌CS022,2周后加强免疫1次。结果表明:口服pcS/2SS基因疫苗后,C组(1×109CFU/只)肉鸡的白蛋白含量较D组明显增加(P<0.05),8周龄时和10周龄时尿素氮含量较D组明显降低(P<0.05)。pcS/2SS基因疫苗对血浆总蛋白、葡萄糖、游离脂肪酸的含量影响不明显。免疫器官指数方面,各组差异不显著(P>0.05),但1×109CFU/只剂量组较对照组(D组)有升高趋势。由以上结果可以看出,口服生长抑素基因疫苗可以提高肉鸡血浆白蛋白的含量,降低肉鸡血浆尿素氮含量,对血浆总蛋白、葡萄糖、游离脂肪酸的含量影响不明显,免疫器官指数有升高趋势,1×109CFU/只为较适宜剂量。     

DNA疫苗制备工艺研究

以禽流感DNA疫苗pCAOH5转化大肠杆菌JM109后,利用发酵罐进行发酵培养。将菌体悬浮裂解中和后,经澄清和浓缩处理,利用阴离子交换色谱对其进行纯化。结果表明实验室规模的技术路线完全能够为质粒DNA的工业化制备奠定技术基础。     

Vaccination of Plasmid DNA Encoding Somatostatin Gene Fused with GP5 Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Induces Anti-GP5 Antibodies and Promotes Growth Performance in Immunized Pigs

Somatostatin （SS） is a hormone that inhibits the secretion of growth hormone. Immunization against SS can promote the growth of animals. This paper described the effects of DNA immunization on the growth and antibody response in mice and pigs immunized with a plasmid DNA encoding SS fused with GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）. A fragment of 180 bp encoding partial SS gene was amplified by PCR from the genomic DNA of peripheral blood mononuclear cells of pigs, and cloned as a fusion gene with PRRSV GP5 in plasmid pISGRTK3. Three times of immunization with the resulting plasmid pISG-SS/GP5 induced anti-GP5 antibodies in BALB/c mice and pigs, as demonstrated by GP5-specific ELISA and immunoblotting. Compared with pigs immunized with empty vector pISGRTK3, the growth performance of pigs immunized with pISG-SS/GP5 was increased by 11.1% on the 13th week after the last vaccination. The results indicated the plasmid DNA encoding SS and PRRSV GP5 fusion gene elicited anti-GP5 antibodies and improved the growth performance of immunized pigs.     

EDSV六邻体蛋白基因核酸疫苗对减蛋综合征灭活油乳苗的免疫协同作用

利用所构建的减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因真核表达质粒pcDNA3-hexon和减蛋综合征灭活油乳苗,观察了EDSV六邻体蛋白基因核酸疫苗对减蛋综合征灭活苗的免疫协同作用。结果显示,7日龄时应用核酸疫苗和减蛋综合征灭活油乳苗联合免疫的鸡群,在14~56日龄整个观察期内,胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应,均明显强于单纯油乳苗免疫组(其中,除在接种后第7天两组鸡的B淋巴细胞增殖OD570值差异不显著外,其余各检测时间两组间均表现为显著或极显著差异);特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第14天后均表现为差异极显著。而且,HI抗体效价水平也持续性高于单纯灭活油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后35~49 d时差异显著。说明EDSV六邻体蛋白基因核酸疫苗与灭活油乳苗联合免疫,可明显提高机体的细胞免疫和体液免疫水平,产生很好的免疫协同作用。     

白细胞介素-10分子佐剂增强口蹄疫DNA疫苗黏膜免疫效果研究

 【目的】研究白细胞介素-10作为黏膜分子佐剂是否可以增强口蹄疫DNA疫苗（pcD-VP1）的黏膜免疫应答。【方法】利用RT-PCR技术以Balb/c小鼠脾脏组织总RNA为模板,扩增出小鼠的IL-10基因,并构建真核表达质粒proVAX-IL-10, 通过鼻腔接种方式,将口蹄疫DNA疫苗（pcD-VP1）和真核表达质粒（proVAX-IL-10）共同免疫小鼠,用ELISA法检测免疫小鼠黏膜部位（肺脏、生殖道）sIgA滴度,免疫组织化学法检测气管、生殖道和小肠中sIgA 的表达情况,CSFE染色法检测小鼠扁桃体淋巴细胞增殖反应水平,用胞内细胞因子染色法通过流式细胞仪检测扁桃体部位CD4+阳性T细胞内IFN-γ和IL-4的表达量。【结果】成功构建了proVAX-IL-10真核重组质粒,且重组质粒可以在BHK细胞中有效表达;将proVAX-IL-10与口蹄疫DNA疫苗pcD-VP1共同免疫小鼠后发现,与单独接种pcD-VP1相比,加入IL-10分子佐剂后,可以诱导更高水平的黏膜sIgA的表达及分泌,极大的提高了黏膜部位抗原特异性T细胞增殖反应水平以及CD4+ T细胞中IL-4的表达量。【结论】IL-10作为分子佐剂,通过鼻腔黏膜免疫后,可以有效增强机体对口蹄疫DNA疫苗的黏膜免疫应答,对于预防口蹄疫病毒的感染和清除体内病毒起到重要的作用。     

犬白细胞介素-7基因对犬细小病毒DNA疫苗的免疫增强作用

【目的】白介素-7是动物体一种重要的多功能细胞因子,在促进B细胞、T细胞的形成和发育,在协同其它细胞因子提高机体免疫能力等方面发挥重要作用。本试验利用犬细小病毒VP2 DNA疫苗,在小鼠体内分析了犬白介素-7（cIL-7）基因的免疫增强作用。【方法】采用RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中扩增cIL-7基因,然后将cIL-7基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,分别构建成与Myc/His标签融合和非融合的cIL-7真核分泌型表达载体pcDNA-cIL7/MH和pcDNA-cIL7。由磷酸钙介导将pcDNA-cIL7/MH质粒转染HEK 293T细胞使其进行瞬时表达,以Western-blot检测构建的表达载体能否介导cIL-7基因在真核细胞中进行分泌表达。用已构建的VP2表达载体pcDNA-CD5-VP2与pcDNA-cIL7载体共免疫小鼠,并设pcDNA-CD5-VP2单免疫小鼠和pcDNA-cIL7单免疫小鼠作为对照。免疫后通过ELISA方法检测抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验和ELISA方法分别检测免疫后35 d小鼠脾脏淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素的表达水平。【结果】本试验扩增的cIL-7基因序列与GenBank中犬的序列完全一致。构建的表达载体能够介导cIL-7基因在HEK293T细胞中进行分泌表达。动物免疫试验结果显示,cIL-7与VP2共免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价分别极显著和显著高于VP2单免疫组（P＜0.01和P＜0.05）;共免疫组小鼠淋巴细胞刺激指数和γ-干扰素表达水平也显著高于VP2单免疫组（P＜0.05）。【结论】cIL-7基因可增强小鼠对VP2 DNA疫苗的免疫应答反应。     

日粮添加半胱胺对淮南麻鸭生长性能和血液中生长抑素水平的影响

研究旨在观察在日粮中添加不同剂量半胱胺对淮南麻鸭生长性能及血液中生长抑素水平的影响.选用1日龄淮南麻鸭200羽,随机分成4组,每组5个重复,每个重复10羽.从8日龄开始,分别在基础日粮中添加半胱胺0（对照组）、100、200、400 mg· kg-1（试验组）,连续饲喂28 d.结果表明,与对照组相比,添加半胱胺组的麻鸭试验末体重和日增重均显著提高（P＜0.05）,其中添加半胱胺200 mg· kg-1组麻鸭生长指标最佳;添加半胱胺组的麻鸭血液中生长抑素水平均显著降低（P＜0.05）,其中添加200 mg· kg-1剂量组麻鸭血液中生长抑素水平值最低.试验结果表明,日粮中适当添加半胱胺制剂可以促进淮南麻鸭生长发育,且其机制与降低血液中生长抑素浓度有关.     

猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力

试验以猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）的ORF5和猪圆环病毒2（PCV-2）的ORF2为目的基因,以pIRES-neo为表达载体,构建了PRRSV—PCV-2二联核酸疫苗,并对其免疫原性进行了初步的研究,为研制安全有效的疫苗防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供基础。     

生长抑素DNA疫苗pEGS/2SS在大鼠体内的表达与分布

给SD大鼠股四头肌注射带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGS／2SS,每只100μg。注射后不同时间剖杀,取注射部位肌肉、心、脑、垂体、肝、脾、肾、小肠、胃、子宫、卵巢作冰冻切片,于荧光显微镜下检查。发现pEGS／2SS仅在注射部位肌肉表达,72h表达最强,10d后明显减弱,2周后消失。其他组织及对照组未检测到绿色荧光。表明pEGS／2SS在体内表达、分布方面具有较好的安全性。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力

[目的]构建猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病的二联核酸疫苗并研究其免疫效果。[方法]将辽宁某猪场发病猪病料中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF5基因克隆至真核表达载体pIRES-neo的CMV启动子下游,然后用猪2型圆环病毒（PCV-2）的内蒙古分离株的ORF2基因替换pIRES的neo基因,构建真核表达质粒。通过W estern blot和IFA方法检测构建的重组质粒在BHK细胞中的表达情况。将重组质粒免疫Balb/c小鼠,检测免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群的数量。[结果]成功构建了重组表达质粒pIRES-ORF2-ORF5,W estern blot和IFA试验证实该重组质粒在BHK细胞内成功表达了目的蛋白。与灭活苗相比,pIRES-ORF2-ORF5核酸疫苗免疫小鼠ELISA抗体水平差异不显著;其脾T淋巴细胞亚群数量显著高于灭活疫苗免疫组。[结论]构建的二联核酸疫苗能够诱导小鼠产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应,为更好地防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供了条件。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的DNA疫苗免疫保护效力研究

 表达高致病力禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) [GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA5具有良好的免疫保护性,为了将其开发并应用于实际,对其免疫保护效力进行了进一步的研究。结果表明,用10、40、70、100和150g pCIHA5和油苗1次免疫后,其免疫保护率分别为12.5%(1/8)、58.3%(7/12)、72.7%(8/11)、50.0%(6/12)、66.7%(8/12)和100%(12/12),其中70和100g剂量组的病毒分离结果     

鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗的构建及鉴定

[目的]构建含鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK抗原基因及鸡IFN-γ基因的三价DNA疫苗。[方法]应用SOE-PCR将3-1E、CD-PK和鸡IFN-γ共3个基因通过2个（GGGGS）3连接子相连,扩增出IFN-γ/3-1E/CDPK三价融合基因,将其克隆入真核表达载体proVAX中构建三价融合真核表达质粒proIEC,后用双酶切和PCR进行鉴定。阳性重组质粒提取纯化后体外转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达情况。[结果]经双酶切和PCR鉴定证实鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗构建成功,且在PK-15细胞中获得了成功表达。[结论]鸡柔嫩艾美耳球虫IFN-γ/3-1E/CDPK三价DNA疫苗构建成功,为进一步探讨其免疫保护性奠定了基础。