摘除眼柄对河南华溪蟹蜕皮激素与几丁质酶含量和β-NAGase活性的影响

为探索摘除眼柄对河南华溪蟹蜕皮机制的影响,采用灼伤挤压法摘除眼柄后,运用ELISA技术检测了河南华溪蟹血淋巴中蜕皮激素的含量和表皮组织中几丁质酶的含量,同时用比色法测定了表皮中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(β-NAGase)的活性。结果显示,摘除眼柄后河南华溪蟹血淋巴中蜕皮激素的含量出现先升高后下降的总趋势,在摘除眼柄96 h时,血淋巴中蜕皮激素含量上升到最大值[♂:(23.25±4.56)ng/L;♀:(35.75±7.15)ng/L]。表皮中几丁质酶的含量在摘除眼柄后亦出现先升高后下降的变化趋势,在摘除眼柄48 h达到最大[♂:(16.29±3.91)ng/L;♀:(30.49±5.28)ng/L],到120 h仍显著高于对照组。表皮中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(β-NAGase)的活性在摘除眼柄后持续升高,在144 h时达到最大[♂:(400.44±21.00)U/g;♀:(216.94±23.97)U/g],后逐渐下降,但依旧高于对照组。研究推测,摘除眼柄通过增加蜕皮激素含量、几丁质酶的含量和β-NAGase的活性来促进河南华溪蟹蜕皮。实验将为进一步研究甲壳动物蜕皮生长的调控机制提供新的理论基础。     

养殖常用消毒药物对凡纳滨对虾NAGase活力的影响

研究几种消毒药物对来源于凡纳滨对虾壳膜与内脏的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAcase,EC 3.2.1.52)活力的影响.结果表明,次氯酸钠和三氯异氰尿酸对2种来源的NAGase活性均有较强的不可逆抑制作用;双链季铵盐对壳膜NAGase活性起强的激活作用,而对内脏NAGase有轻微的抑制作用;戊二醛对壳膜NAGase没有明显作用,对内脏NAGase具有轻微的激活作用.     

壳聚糖的生物学功能及其在家禽生产中的应用

壳聚糖(Chitosan)又称脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素、脱乙酰甲壳素、聚氨基葡萄糖，化学名称是(1，4苷)-2-胺基-2-脱氧-B-D葡萄糖，是由甲壳素(Chitin)脱乙酰基后的产物。甲壳素又名甲壳质、几丁质，是N-乙酰基-D-氨基葡萄糖通过β-(1，4)糖苷键连接而成的直链多糖，广泛存在于虾、蟹等甲壳类动物的外壳以及真菌的细胞壁中。在自然界中，甲壳素的年生物合成量巨大，     

壳聚糖及其衍生物对水产养殖水质的净化作用

壳聚糖又称可溶性甲壳质、甲壳胺,学名为（1,4）聚-2-氨基-2-脱氧-β—D-葡聚糖,是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖单体通过β—1,4糖苷键连接起来的直链状高分子化合物。壳聚糖能从甲壳生物的外壳或昆虫的外骨骼中提取,来源极其丰富。     

罗非鱼鳃组织中脂肪氧合酶的性质研究

试验结果表明脂肪氧合酶最适反应温度为30℃,最适pH为10.0和4.0。在pH10.0的条件下,最适底物浓度为2.5×10-4mol/L,Km值为0.073mmol/L,Vmax值为3.08×104U/mgprotein.min。EDTA对该酶有较强的抑制作用。而在pH4.0的条件下,最适底物浓度为5×10-4mol/L,BHA、BHT、TBHQ等抗氧化剂有较强的抑制作用。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对南极磷虾类胰蛋白酶的抑制动力学

为了探讨大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对南极磷虾(Euphausia superba)类胰蛋白酶的抑制动力学,采用邹氏不可逆抑制动力学法,测定了STI对该酶的微观速度常数。结果表明:南极磷虾类胰蛋白酶的Km和Vmax分别为0.155 mmol/L,8.44μmol/(L.min)。酶活力随着STI溶液浓度增大而减小,其IC50约为2.8μg/mL;低浓度的STI溶液对酶的抑制作用为竞争性慢可逆抑制。正向微观速度常数k+0为0.184 mmol/(L.min),逆向微观速度常数k-0为0.039 4 min-1,随着STI溶液浓度的逐渐增大,该酶最终将完全失活。本研究旨为该酶的抑制技术研究提供实验数据。     

KK-42对日本沼虾D3期头胸甲表皮结构的影响

为探讨KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制,实验采用组织学方法观察了幼虾头胸甲表皮结构,定量测定了肝胰腺N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的活力。将体长(3.3±0.5)cm的日本沼虾随机分为两组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液(实验组)或不含KK-42的溶液(对照组)浸泡处理1 min之后,选取处于蜕皮前期D3期的日本沼虾,观察头胸甲表皮结构,测定肝胰腺NAGase活力。结果显示,KK-42处理后第1天,头胸甲外表皮厚度与对照组相比显著增长42.83%;第3天和第9天,内表皮的厚度同比提高70.72%、77.27%,整个头胸甲的厚度同比显著增厚。KK-42处理后第3天,上皮细胞的高度比对照组提高31.69%。KK-42处理后6、12和24 h,NAGase活力分别比相应的对照组升高42.53%、34.28%和18.36%。研究表明,KK-42处理可显著增加D3期日本沼虾头胸甲外骨骼的厚度,提高肝胰腺NAGase活力。     

日本对虾血清凝集素的基本物理化学性质

日本对虾（Penaeus japonicus)亲虾体长19-24.5cm，取其血清。7种动物血液取自大白鼠、小白鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、人。结果表明：（1）虾血清分别在28、37、56℃时热处理30min，其凝集活性不变，在70℃和80℃热处理30min后凝集活性完全丧失。（2）血清在pH和5-7.5的TBS缓冲液中凝集活性稳定，在pH为8-9之间凝集活性迅速下降。（3）凝集抑制实验表明半乳糖、甘露糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺等5种糖对血清凝集素都有较强的抑制作用，尤其D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺的抑制作用更强。（4）交叉吸附实验结果显示日本对虾血清对大白鼠、小白鼠的红细胞有较强的亲和性。     

虾壳的微生物转化和菌种的筛选

从水产品加工场长期堆放虾壳的土壤中,分离出一株能分解虾壳有较高活力的菌株。对该菌株(ST90-5)进行了形态、培养特征、生理生化特性等鉴定,此菌为放线菌(Streptomyces sp.)。这一菌株是用甲壳质为唯一碳源的筛选培养基中筛选出来,培养基成份为Na_2HPO_4、KH_2PO_4、NH_4NO_(?)、MgSO_4·7H_2O、FeSO_4·7H_2O、CaCl_2、甲壳质、微量金属盐。该菌株产酶最适条件为pH7、温度30℃、120r/min旋转摇床培养4—7天。经过发酵的培养液测定β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的活性。     

甲壳低聚糖的酸水解

不同浓度（2、3、4、6mol/L）HCl）对壳聚糖、低聚氨基葡萄糖、氨基葡萄糖单糖的降解实验表明，在100℃并有氩气保护的条件下，HCl在水解氨基葡萄糖聚糖的同时对所生成单糖的分子结构有较强的破坏作用，2、3、4、6mol/L的HCl所破坏的氨基葡萄糖分子数N与HCl浓度C HCl和水解时间t之间的关系遵循方程：N=0.0854C HCl t。氨基葡萄糖的回收率y'对HCl浓度及分解时间的方程为：y'=-0.0854 C HCl t 100。HCl降解聚氨基葡萄糖的动力学反应受HCl浓度和底物聚合度的影响，生成单糖的产率随水解时间延长、HCl浓度增大而增加，但在相同HCl浓度和水解时间条件下，聚合低则降解进程快。6mol/LHCl于100℃水解3h对氨基葡萄糖分子结构没有显著的破坏作用，回收率为99.4％，但对低聚氨基葡萄糖、壳聚糖的水解产率均很低，分别为33.6％、33.2％。本研究结果证明，壳聚糖较好的分解条件为HCl浓度4mol/L、水解72h，此时单糖水解产率可达89.6％。     

淬灭酶AiiO-AIO6酶学性质及对嗜水气单胞菌毒力因子的表达调控

将N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因(aiiO-AIO6)插入表达载体pET28a构建了原核表达载体pET28a/ aiiO-AIO6.转化大肠杆菌后筛选具有活性的重组子并对纯化的目的蛋白AiiO-AIO6的酶学性质进行了研究,同时研究了纯化的酶液对嗜水气单胞菌ATCC7966溶血素( Hemolysin,Hem)、细胞肠毒素(Cytotonic enterotoxin,Ast)、胞外蛋白酶(Extracellular protease,Ep)、丝氨酸蛋白酶(Serine protease,Sp)及磷脂酶Pho( Phospholipase Al,Pho)等5个毒力因子表达的影响.结果表明,pET28a/aiiO-AIO6在大肠杆菌中大量表达N-乙酰高丝氨酸内酯酶,纯化后的N-乙酰高丝氨酸内酯酶的最适作用条件为pH8.0,30℃,在pH 6.0 ～11.0的范围内能够稳定的存在,在80℃条件下保温30 min后酶活力能够维持在65％以上;且该酶对多种金属离子、化合物和中性蛋白酶都具有很好的抗性;该酶对多种底物都具有一定的降解作用;以3-oxo-C8-HSL为底物时的km值为0.015 mmol/L;比活力为583.33 U/mg.N-乙酰高丝氨酸内酯酶在培养8h及12 h时对嗜水气单胞菌5个毒力因子的表达量都具有明显的下调趋势(P＜0.05).本实验通过测定AiiO-AIO6的酶学性质及证明AiiO-AIO6可以通过降解嗜水气单胞菌产生的信号分子来抑制其毒力因子的表达,从而为将其应用于水产环境及致病性嗜水气单胞菌的生物防治奠定理论基础.     

微生物几丁质酶的研究进展、应用及展望

从海洋微生物橙黄小单孢菌 (Micromonosprra aurantiaca) 的基因组DNA中克隆到一条新型的碳水化合物18家族几丁质酶基因Machi3,并成功在大肠杆菌 (Escherichia coli) 中表达。该酶的最适反应温度和pH分别为55  ℃和7.0,在低于55  ℃和pH 6.0~9.0范围内稳定性较好。镁离子 (Mg²⁺)、钙离子 (Ca²⁺)、吐温40 (Tween 40) 和吐温80 (Tween 80) 对MaChi3的酶活力有轻微的促进作用。该重组酶对α-几丁质、胶体几丁质、虾壳粉、不同脱乙酰度 (50%~95%) 的壳聚糖、淀粉及纤维素均具有水解活性,其中以胶体几丁质为底物时酶活力最高 (2.24 U·mg⁻¹)。由扫描电镜结果可知,几丁质经盐酸 (HCl) 预处理后得到的胶体几丁质纤维结构变得松散,更有利于MaChi3的水解作用。以胶体几丁质为底物时动力学参数K_m和V_max值分别为5.93 mg·mL⁻¹和8.58 μmol·(min·mg)⁻¹。此外,胶体几丁质经MaChi3酶解后生成的主产物为N, N-二乙酰基壳二糖,产率 (几丁质) 为285.54 mg·g⁻¹。该酶展现出良好的酶学特性,为其在几丁质资源中的开发和应用奠定了基础。

     

中国对虾NAGase基因SNP标记的筛选及与耐高pH性状的关联分析

为探究N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因(NAGase)对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)耐高pH性状的影响,本研究采用直接测序法及实时荧光定量PCR法检测FcNAGase的多态性,并分析其与中国对虾耐高pH性状的相关性。通过直接测序,在FcNAGase上共检测到29个潜在的SNP位点,分布频率为1.13/100 bp,其中,内含子的突变频率为0.35/100 bp,外显子的突变发生频率为0.78/100 bp。通过荧光定量PCR方法在中国对虾耐高pH性状分离群体中共检测到14个具有多态性的SNP位点,其中,观测杂合度(Ho)为0.2581~0.9390,期望杂合度(He)为0.0595~0.4490,多态信息含量(PIC)为0.0574~0.3731;利用卡方检验进行关联性分析,发现2个与中国对虾耐高pH性状显著相关的位点(P<0.05),分别为P12(P=0.036)和P27(P=0.018),本研究结果可为中国对虾分子标记辅助育种研究提供基础数据和方法。     

异育银鲫肝微粒体体外恩诺沙星N-脱乙基酶酶促反应动力学初步研究

建立了异育银鲫肝微粒体体外孵育恩诺沙星(enrofloxacin,EF)的酶促反应体系,应用RP-HPLC法检测其主要代谢产物环丙沙星(ciprofloxacin,CF),以间接反映恩诺沙星N-脱乙基酶的活性。采用二氯甲烷提取、正已烷去脂提取有效成分,样品回收率均大于81.4%,含CF或EF的肝微粒体样品能在4℃下稳定至少72 h,日内变异系数不超过3.51%,日间变异系数不超过3.71%,EF和CF准确度分别小于8.1%、6.5%,检测限(信超比为3)分别为0.15μmol/L、0.3μmol/L。恩诺沙星在银鲫肝微粒体中代谢符合一级消除方程C=140e-0.072t,消除速率常数(K)为0.072/h,消除半衰期(T1/2)为9.627 h。用Origin Lab软件的Hyperbl模型进行拟和,以方程y=P1.x/(P2+x)表示米氏常数Vmax、Km两者的关系,求得Vmax为0.2602±0.0147nmol/mg.min,Km为53.8985±10.2257μmol/L,内在清除率(Clint)约为0.0048 mL/(min.mg)。恩诺沙星消除率和环丙沙星转化率的研究结果提示,恩诺沙星在银鲫肝微粒体中的代谢以N-脱乙基反应为主,提示可能还通过其它途径生成另外代谢产物。而酶动力学研究数据(Vmax,Clint值)表明,恩诺沙星N-脱乙基酶与底物结合力不强,酶促反应强度处于中等水平。据此,笔者推测恩诺沙星在银鲫肝微粒体中的代谢速度较为缓慢。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白的细菌凝集活性

以凡纳滨对虾（Litopenaeaus vannarnei）为研究对象，运用亲和层析、PAGE、SDS-PAGE、Western-blotting和细菌凝集实验等方法探索凡纳滨对虾血蓝蛋白的细菌凝集活性。结果发现，血蓝蛋白对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻酸弧菌（Vibrio alginolyticus）、河弧菌（Vibrio fluvialis）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、嗜水气单胞菌（Agromona hydrophila）和金黄色葡萄球菌（Stphylococcus aureus）等6种虾类致病菌具有凝集活性，其凝集活性大小为0．27-1．08mg／L，其中对副溶血弧菌和溶藻酸弧菌凝集活性最大，是哈维氏弧菌的4倍。在此基础之上，选取α-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-山梨糖、蔗糖、麦芽糖、α-D-乳糖、甘露醇和N-乙酰神经氨酸等9种糖考察其对血蓝蛋白细菌凝集活性的影响。结果显示，血蓝蛋白的细菌凝集活性可被α-D-葡萄糖和N-乙酰神经氨酸所部分抑制和全部抑制，其最低抑制浓度范围为50～100mmol／L。由此推测，血蓝蛋白确实具有细菌凝集活性，这对进一步研究血蓝蛋白的抗菌机理具有重要意义。     

乙酰甲喹对小新月菱形藻、等鞭金藻3011的毒性效应

通过考察乙酰甲喹对小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)、等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke3011)的生长抑制和对叶绿素a、总超氧岐化酶(T-SOD)活性以及丙二醛(MDA)浓度的影响,研究了乙酰甲喹对2种微藻的毒性效应,为评价兽药乙酰甲喹的使用安全性和保护养殖环境提供基础数据。结果表明,乙酰甲喹对2种微藻的生长抑制作用随质量浓度的增加而增大,乙酰甲喹对小新月菱形藻的24 h-EC50(半数有效浓度)为4.73 mg·L~(-1)、对等鞭金藻3011的24 h-EC50为2.14 mg·L~(-1),乙酰甲喹对2种微藻均属于高毒物质,等鞭金藻3011更敏感。暴露24 h后,随着乙酰甲喹质量浓度的升高,小新月菱形藻叶绿素a浓度下降而等鞭金藻3011叶绿素a浓度基本不受影响;2种微藻的T-SOD活性随着乙酰甲喹质量浓度的升高均显著增加,各实验组MDA浓度也高于对照组,等鞭金藻3011更敏感,说明乙酰甲喹对2种微藻均能造成氧化胁迫,对细胞造成氧化损伤。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定

对黄海黄杆菌YS-9412-130菌株产低温碱性蛋白酶的理化性质研究表明，该酶由256个氨基酸组成，分子量为33000Dar，等电点pI为9.45，米氏常数Km为5×10-3mmol/L；酶的最适作用pH范围为9.5～10.5，最适作用温度30℃，具有一定的抗氧化稳定性。Ca2+、Mn2对酶有激活作用，而Hg2+、Ag+对酶有抑制作用。DFP、NBS严重抑制酶的活性,而同时该酶也能被EDTA抑制。结果表明该低温碱性蛋白酶为一新型的丝氨酸蛋白酶。     

草鱼酸性磷酸酯酶的性质及金属离子对其活性的影响

以草鱼肝脏为材料提取一种酸性磷酸酯酶(ACPase,EC.3.1.3.2),进一步用(NH4)2SO4沉淀分离,Sephadex G-200柱纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定呈现单一酶蛋白带,该酶紫外吸收峰为240nm和280nm,等电点为4.8,相对分子质量为100046.1。该酶水解对硝基苯磷酸二钠(pNPP)的最适pH值为4.4,最适温度为45℃,并有热激活现象,热激活温度为60℃。耐热实验表明,该酶在最适温度下耐热时间为33min,最适温度下20min时表现出最大活性。在60℃下耐热时间为25min,15min时表现最大活性。酶促反应初速度为0.0475μmol/min,最大反应速度为0.153μmol/min。米氏常数Km值为3.56×10-3mol/L。金属离子对酶活性影响的研究结果表明,K+对酶有激活作用,Li+、Na+对酶的活性没有明显影响;碱土金属离子Mg2+、Ca2+和Ba2+对酶有激活作用,其激活程度由大到小依次为:Ba2+、Mg2+、Ca2+;Mn2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+、Co2+则有抑制作用;重金属离子Hg2+、Pb2+、Ag+和Cd2+对酶有抑制作用,其中Hg2+的抑制效应最强。Mg2+和Cu2+的作用机制研究结果表明,Mg2+对酶具有混合型激活作用,Cu2+对酶具有竞争性抑制作用。     

乌贼内壳中β-壳聚糖的制备研究

本文研究了用乌贼内壳制备β-甲壳素和壳聚糖,结果乌贼内壳背楯提取甲壳素的最佳条件为:先用1.5 mol/L HCl浸24 h,再用1.5 mol/LNaOH于80℃浸3 h。产率为3.55％。从乌贼内壳周缘提取甲壳素的最佳条件为:先用1.5 mol/LHCl浸24 h,再用1 mol/L NaOH75℃浸3 h,产率为30％;产品用IR和XRD表征。实验结果还表明,加入相转移催化剂可提高β-壳聚糖的脱乙酰度。     

黄颡鱼肝脏胞质中NADP依赖性的异柠檬酸脱氢酶(IDPc)的分离纯化和酶学性质

采用Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE Sepharose离子交换、Sephadex G-25凝胶过滤等方法对黄颡鱼肝脏胞质中NADP依赖性的异柠檬酸脱氢酶(IDPc)进行纯化,并研究其相关的酶学性质。结果显示,IDPc的比活力为7.94 U/mg,亚基分子量为36.7 ku。IDPc活性最大时的pH和温度分别为8.0和65℃,活化能为81.33 kJ/mol,底物米氏常数KmNADP和KmIC分别为0.056和0.175 mmol/L,底物最大反应速率VmNADP和VmIC分别为9.04和10.51U/mg,催化效率KcatNADP和KcatIC分别为0.16和0.06 min/mg,产物NADPH对IDPc表现为竞争性抑制,抑制常数KiNADPH为0.034 mmol/L。IDPc的催化作用强烈依赖于金属离子Mn2+、Mg2+,没有金属离子存在时反应几乎不进行,二价金属离子激活IDPc的顺序为Mn2+Mg2+Zn2+Ca2+Cu2+,Cu2+几乎不能激活IDPc的活性。Ca2+和Zn2+既是激活剂也是抑制剂,与其作用浓度有关,Cu2+基本上对其无影响。通过对IDPc系统的酶学性质探讨,能够为深入研究IDPc催化与调节机制奠定基础。