多重PCR检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性等位基因

 利用GenBank发表的捻转血矛线虫β微管蛋白基因组DNA序列设计2对引物,建立检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的多重PCR方法,利用该方法检测我国不同地区捻转血矛线虫对苯并咪唑类药物的抗性,并用生物学检测验证。结果表明,建立的多重PCR方法在抗性检测上具有很强的特异性,澳大利亚抗性虫株只有F1和F3条带,上海敏感虫株只有F2和F3片段;序列分析证实抗性虫株编码β微管蛋白第200位氨基酸的密码子为TAC,敏感虫株为TTC。并且该法具有很高的灵敏性,检测基因组DNA的最低量为50 ng。生物学检测,澳大利亚抗性虫株丙硫苯咪唑LD50达0.54 ?g·ml-1,上海敏感虫株的LD50为0.0023 μg·ml-1,与多重PCR结果相符,说明多重PCR可以用于捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的检测。利用该技术检测源于新疆石河子、伊宁,安徽五河,江苏南京、徐州等地的虫株发现,这些地理株均表现为敏感型,丙硫苯咪唑LD50在0.0023～0.0032 ?g·ml-1之间,提示我国捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性尚不严重。     

羊捻转血矛线虫病的综合诊断与治疗

捻转血矛线虫病是羊常见的寄生虫病。某场羊出现精神不振,食欲下降,被毛粗乱,贫血,消瘦,颈下、胸前水肿等症状,通过发病情况调查、临床症状观察、剖检和进行虫种鉴定,确诊为羊的捻转血矛线虫病。通过皮下注射1％阿维菌素,治疗效果良好。     

捻转血矛线虫H11部分功能域基因的原核表达与分析

    生物信息学软件分析表明,捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)ZJ株的H11抗原基因含有4个糖基化位点与1个锌结合区,为分析这些功能域在H11天然抗原诱导的免疫保护中的作用,对H11部分基因进行克隆和表达.参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的H11基因序列设计引物,扩增H11开放阅读框670～1710 bp的部分基因序列,命名为HPS(H11 partial sequence).基因片段与表达载体pET-28b分别以NdeⅠ、XhoⅠ酶切后构建重组表达载体pET-28b-HPS,并将其转入大肠杆菌BL21中,提取质粒经PCR和酶切鉴定获得阳性质粒并对其进行测序.结果表明,扩增得到的目的基因片段为 1041 bp,与已发表的ZJ株和国外株参考序列比较,核苷酸同源性分别为100%和98.8%.将重组表达载体用IPTG诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE和Western-blotting检测表明,HPS基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量约为37.34 kDa,诱导6 h的蛋白表达量可达到58.9%.     

捻转血矛线虫H11基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后，用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33，通过含Zeocine^TM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子。重组酵母用甲醇诱导后，经RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达。     

捻转血矛线虫Hc38重组蛋白的表达纯化及抗原性鉴定

[目的]通过表达和纯化捻转血矛线虫新功能基因He38最大开放阅读框ORF1,确定完整的Hc38蛋白天然表达形式、分子量大小和免疫学活性鉴定,为研究该基因功能和基因工程应用奠定基础.[方法]参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的He38基因序列(AY594263)设计引物,PCR扩增目的基因并克隆到表达载体中,重组表达载体转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,SDS-PAGE和薄层扫描检测分析表达产物,通过亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western bloting和ELISA方法检测其抗原性.[结果]Hc38基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白相对分子量约为68 KD,表达量占菌体蛋白总量的30;,亲和层析柱纯化出目的蛋白,并能被捻转血矛线虫病绵羊阳性血清和重组表达产物免疫小鼠血清识别,具有反应原性.[结论]实现了Hc38基因的原核表达和纯化,验证了Hc38基因在虫体内的表达形式和抗原性.     

Detection of Herbicide-tolerant Canola by Multiplex PCR

[Objective]This study aimed to establish a multiplex PCR detection method of herbicide-tolerant canola.[Method] An endogenous reference gene(CruA) and three exogenous genes(T-CaMV 35 S, P-CaMV 35 S and pat) were selected for multiplex PCR. Specific primers were designed based on national standards or related literature. The annealing temperature, ratio of primer concentration and sensitivity of the established multiplex PCR system were optimized. The optimal multiplex PCR system was verified with known samples. [Result] The experimental results showed that the optimal annealing temperature of multiplex PCR was 58 ℃; the optimal ratio of primer concentration(μmol/L) was T-CaMV 35S: CruA: P-CaMV 35S: pat=0.1: 0.2: 0.2: 0.2;the detection sensitivity of the established multiplex PCR method was 0.3 ng. The amplified bands of known samples were completely consistent with the molecular characteristics. [Conclusion] This study provided a rapid, accurate and effective multiplex PCR technique for detection of herbicide-tolerant canola.     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

为建立PCV1和PCV2混合感染快速检测的PCR方法,根据GenBank已发表PCV1和PCV2全基因组序列,设计合成4条引物,通过PCV1和PCV2阳性质粒的构建、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV多重PCR检测方法,可扩增出PCV1和PCV2长度分别为726 bp和433 bp特异性目的基因片段。结果显示,建立的PCV多重PCR可检测到5×101个拷贝的PCV1和PCV2目的基因,HCV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。并初步应用建立的方法对42份采自四川省部分地区的样品进行检测,结果表明,PCV1阳性率为33.3%,PCV2阳性率为45.2%,其中PCV1和PCV2混合感染阳性率为16.6%。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

捻转血矛线虫HLJ株H11基因克隆及部分胞外域表达

根据GenBank上发表的捻转血矛线虫核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆捻转血矛线虫HLJ株H11基因。结果表明,H11ORF核苷酸长为2 919 bp,编码972个氨基酸残基。经分析,捻转血矛线虫HLJ株H11与X94187、AY247714、AY819650同源性分别为99.14%、98.49%和99.59%;H11基因含有4个糖基化位点和1个Zn结合功能域;4个糖基化位点分别位于99~102 aa、227~230 aa、549~552 aa和858~861 aa处;Zn结合功能域位于376~385 aa处。参照捻转血矛线虫HLJ株H11序列设计引物,扩增H11ORF 451~2 919 bp一段胞外域序列,构建包含3个糖基化位点和1个Zn结合功能域pGEX-6P-1-H11原核表达质粒,在大肠杆菌表达菌Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE结果表示,融合蛋白分子质量约为118 ku,以包涵体形式存在。免疫印迹实验未出现目的条带,说明H11确是一种隐蔽抗原。     

捻转血矛线虫H11蛋白提取及其氨肽酶活性分析

试验对体外培养的捻转血矛线虫L4期幼虫和自然感染的成虫的H11天然蛋白分别进行了提取和纯化,并进一步测定了其氨基肽酶活性及酶抑制剂敏感性,为利用捻转血矛线虫天然抗原进行疫苗研制进行了初步探索。结果表明,H11蛋白在L4期幼虫和自然感染成虫体内均有表达,且具有氨肽酶M(ApM)活性和氨肽酶A(ApA)活性,其酶活性能被EDTA及邻二氮杂菲等哺乳动物氨肽酶抑制剂所抑制。H11蛋白是寄生阶段虫体的一种酶类,在对H11蛋白进行操作时,应按照相应的酶处理方法进行,以防变性,影响抗原免疫效果。     

捻转血矛线虫Hc-FAR-4蛋白的表达特性及其与配体结合能力分析

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生在牛羊等反刍动物的皱胃中,引起的捻转血矛线虫病在我国呈全国性流行。文章通过研究脂肪酸与视黄醇结合相关蛋白Hc-FAR-4的表达特性及配体结合能力,以了解其在捻转血矛线虫生长、发育、繁殖过程中的作用。【方法】对Hc-far-4进行克隆、并且构建原核表达载体pET-30a-Hc-far-4,pET-30a-Hc-far-4重组质粒经过PCR与双酶切鉴定准确无误之后转化到E. coli BL21感受态细胞中,用0.1 mmol·L ^-1IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)进行重组蛋白的诱导表达。收集重组蛋白rHc-FAR-4,利用荧光分析法,研究rHc-FAR-4蛋白与DAUDA、视黄醇、油酸的结合能力。配体结合试验是依据荧光物质retinol与脂肪酸类似物DAUDA在极性和非极性溶液中,在某一波长的激发光激发下,所发出的荧光光谱随之变化的特性,判断rHc-FAR-4蛋白是否具有与DAUDA、retinol结合的能力。再在体系中加入非荧光长链脂肪酸油酸,根据荧光光谱的变化情况判定油酸能否分别与DAUDA、retinol竞争目的蛋白的脂肪酸结合位点,间接说明目的蛋白能否与非荧光脂肪酸油酸结合。同时制备鼠源多克隆抗体,利用ELISA技术检验免疫后小鼠的抗体效价,抗体效价合适即可收集小鼠血清。收集的血清用于免疫组织荧光（IHF）试验,探究Hc-FAR-4的表达部位,从而推测其功能。该试验过程为：对捻转血矛线虫进行石蜡包埋,石蜡切片,抗原修复,3%的BSA 于4℃封闭过夜,自制鼠源多克隆抗体作为一抗孵育1 h; Alexa Fluor? 488 nm羊抗鼠IgG作为二抗避光孵育1 h,DAPI染色30 min,激光共聚焦显微镜检查染色情况。利用荧光定量PCR技术分析Hc-far-4在捻转血矛线虫各个主要阶段的表达特性。【结果】成功克隆目的基因Hc-far-4,测序结果与Sanger数据库中捻转血矛线虫far-4基因序列（>HCISE00908800.t1）相似度为 99.9%;重组质粒 pET-30a-Hc-far-4在E. coli BL21中成功表达,在诱导8 h后达到峰值。经过ELISA检测,结果显示制备的鼠源多克隆抗体效价达到1﹕1 024 000—1﹕2 048 000,可用于后续试验。Western Blot鉴定结果显示rHc-FAR-4重组蛋白带有His标签,并且条带大小为25 kD,结果符合预期。制备的鼠源多克隆抗体经过Western Blot鉴定,能够与天然Hc-FAR-4 蛋白结合,说明该抗体可用于IHF试验。配体结合试验结果表明 rHc-FAR-4蛋白具有结合脂肪酸与视黄醇的能力。荧光定量PCR分析表明,Hc-far-4在四期幼虫中的转录水平最高;IHF试验表明,Hc-FAR-4主要表达在捻转血矛线虫的肠壁、性腺中。综上推测Hc-FAR-4蛋白主要在寄生生活阶段参与了转运脂肪酸与视黄醇,为捻转血矛线虫的生长发育与生殖提供营养物质。【结论】捻转血矛线虫 FAR-4 蛋白能够结合脂肪酸类似物DAUDA和视黄醇,但是与油酸的结合能力较弱,主要表达在肠壁,在性腺、角皮中也有少量表达,其基因在进行营寄生生活阶段时表达量达到峰值。     

冰鲜鸡肉中致病菌三重PCR检测方法的建立

【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103 CFU/mL,单重的灵敏度达到101 CFU/g,模拟实际样品检测中,经过20 h的前增菌后,三者同时检出的灵敏度达到101 CFU/g,单重PCR的灵敏度达到100 CFU/g;对60份屠宰线上的鸡胴体样品和32份超市鸡肉样品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的检出率分别为20%、3.3%、21.7%(屠宰线样品)和25%、21.9%、6.25%(超市样品)。【结论】成功建立了可同时检出鸡肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157的三重PCR方法,可为生产一线的致病菌检测提供参考。     

陕西小麦黄矮病病原种类的多重PCR检测

为了有效预防和防治小麦黄矮病提供相关参考依据,在田间调查的基础上,利用大麦黄矮病毒多重PCR检测技术对2009-2010年陕西地区主要小麦产区的小麦黄矮病进行大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus,BYDV)3个病原种PAV、GPV、GAV的检测.结果表明,2010年除陕西凤翔地区发病指数略高于2009年发病指数外,其余地区的发病率和发病指数均有不同程度的下降,调查地区小麦黄矮病混合侵染现象严重,且以GPV、GAV和PAV混合侵染为主.     

鸭源大肠杆菌3种tet基因的多重PCR检测

利用肉汤稀释法测定21株鸭大肠杆菌对四环素等7种抗茵药物的敏感性,并用多重PCR方法同时检测3种四环素耐药基因(tetA、tetB和tetC).结果显示:所有菌株均呈现tetA、tetB和tetC基因阳性,与药敏试验结果阳性符合率76.67%,携带3种tet基因的临床分离鸭大肠杆茵不仅对四环素类药物耐药,还对头孢噻肟、...     

三种常见食源性致病菌的多重PCR快速检测

为建立对3种食源性致病菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的快速、敏感、特异的多重PCR诊断检验方法,本研究设计了上述3种菌的特异性PCR引物,通过单一、双重及三重PCR反应检测,并对人工感染的饮料和面包2种食品进行验证.结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均成功扩增出目的片断,没有非特异性扩增.人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定.本研究所建立的多重PCR反应系统具有较好的特异性和灵敏性,为食品中常见致病菌的检测提供了一种快速、简便、可靠的方法,具有重要的理论意义及实践意义.     

多重PCR法在微卫星标记中的效果观察

通过建立一种同时检测3个位点（MCW0083、MCW0037、LEI0166）的多重PCR方法,在同一样品中同时扩增这3个微卫星位点。混合扩增产物与各位点单引物PCR法扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,用BandScan软件分析各微卫星位点的等位基因大小。多重PCR方法扩增出的DNA片段与单PCR扩增的结果表明,每个个体标记等位基因的片段大小差异不大,初步认为该方法是可行的。     

猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病复合PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株(ATCC VR-2332)的部分ORF6及ORF7保守序列和已发表的猪圆环病毒株PCV-2(DQ195679)的ORF-2基因保守序列,设计合成了2对特异引物,分别扩增出大小为426 bp和631 bp特异性基因片段,通过优化RT-PCR和PCR条件,最终建立了可同时检测PRRSV和PCV-2的复合PCR诊断方法。应用此方法分别对河南省不同地区送检的15头份病、死猪的血清、淋巴结、肺、肝等组织进行检测,结果8头份PRRSV阳性,5头份PCV-2阳性,其中3头份PCV-2和PRRSV同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性。结果表明,PRRSV和PCV-2复合PCR诊断方法具有高度特异性和敏感性,可用于兽医临床诊断。     

多重PCR技术在植物生物学研究中的应用进展

多重PCR是近年来兴起的一项分子生物学技术,它是在一个反应体系中同时扩增多个核酸片段的PCR技术,具有高效快捷、成本低廉、适合大量样本分析与鉴定等优点.就多重PCR技术原理及其在植物种质、转基因植株、植物病害、抗病基因和植物育种检测中的应用现状进行了综述,并对其应用前景作了展望.     

正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速、敏感、特异的多重PCR检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR检测,利用正交设计对多重PCR反应体系的镁离子、Toq酶、dNTP、引物的浓度在4个水平上进行L16（4^4）优化试验,并确定该检测方法的特异性与灵敏度。[结果]3对引物能特异性扩增出210、280、393bp的目的条带。利用FTA滤膜提取模板DNA,采用建立多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为3．5×10^2 cfu／ml、沙门氏菌为2．2×10^2 cfu／ml、志贺氏菌为1．0×10^2 cfu／ml。[结论]该检测方法准确、快速、高效,为同时检测食品中多种致病菌奠定了基础。