简单节杆菌treS表达对大肠杆菌抗逆性能的影响

简单节杆菌(Arthrobacter simplex)是工业上普遍使用的甾体C1,2脱氢菌株,转化过程中常常需要添加乙醇等有机溶剂增加疏水性底物的溶解性,但高浓度的有机溶剂会对菌体产生毒害作用.课题组前期通过组学技术发现,海藻糖合成过程中的海藻糖合酶(TreS)与该菌株乙醇胁迫条件下的适应行为密切相关.在此基础上,本文...     

甾体肟的合成及抗肿瘤活性的研究

利用甾体原料合成了4个3β-羟基-5-烯类甾体肟化合物,采用MTT法测定了甾体肟化合物的抗肿瘤活性.结果表明甾体肟化合物对LTEP-α-2细胞具有一定的抑制作用,随受试物浓度的增加,对细胞的抑制作用增强.16-脱氢孕甾烯醇酮肟对LTEP-α-2细胞生长抑制作用最强,IC50值为11.6μg·mL-1.     

虾Y-器官7、8-脱氢酶转化胆固醇为7-脱氢胆固醇研究

[目的]以虾Y-器官微粒体7、8-脱氢酶催化胆固醇,制备7-脱氢胆固醇。[方法]通过单因素试验,研究影响转化反应的各种因素。[结果]将摘除眼柄的刀额新对虾（Metapenaeus ensis）Y-器官,匀浆、离心制备的微粒体酶液,于22℃与胆固醇避光反应6 h,可以积累相对较多的7-脱氢胆固醇。[结论]该研究为利用虾Y-器官7、8-脱氢酶转化胆固醇为7-脱氢胆固醇奠定基础。     

去氢表雄酮生物转化及产物的波谱学结构表征

利用毛霉516对去氢表雄酮进行生物转化,得到三个转化产物。利用IR、ESI-MS 2D NMR等波谱方法检测化合物结构,确证其分别为3β,7α-二羟基-雄甾-5-烯-17-酮(2)、3β-羟基-雄甾-5-烯-7,17-二酮(3)和3β,7α,17β-三羟基-雄甾-5-烯(4)。通过DEPT和~1H-~1HCOSY,HSQC,HMBC等2D NMR技术对产物~(13)C NMR数据进行了全归属,详细地解析了化合物4的结构。     

亚麻荠FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的生物信息学分析

△-12脂肪酸脱氢酶FAD2(fatty acid desaturase 2)和△-15脂肪酸脱氢酶FAD3(fatty acid desaturase 3)是控制亚油酸(18∶2;ω-6)和亚麻酸(18∶3;ω-3)合成的限速酶,亦在植物抵御低温等环境胁迫反应中起重要作用。本文利用生物信息学工具分析了亚麻荠(Camelina sativa)FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的理化性质、二硫键、磷酸化位点、高级结构、保守域和功能系统进化等特征。结果表明,FAD2-1和FAD3-1编码蛋白理论pI相近(分别为8.39和8.42),然而前者不稳定系数(40.04)显著高于后者(29.46)。FAD2-1蛋白的磷酸化位点为23个,多于FAD3磷酸化位点(18个),预示FAD2-1更易受翻译后调控。这两种蛋白均含有3个保守的组氨酸富集区(Hisbox),且在C端含有内质网滞留信号,赋予其定位于内质网和催化双键形成的活性。FAD2-1的a-螺旋比例(45.31%)高于FAD3-1(33.16%),然而后者无规则卷曲比例(51.93%)大于前者(44.53%)。3D结构模拟显示,FAD2-1和FAD3-1功能域大小和构象存在差异,这可能影响到底物选择性和催化效率。这些结果为全面解析亚麻荠种子油脂合成和ω-3族脂肪酸富集的分子机理提供了科学参考。     

酶法水解3-氰基吡啶制备烟酸

以筛选出的腈水解酶β1粗酶作为催化剂,可将3-氰基吡啶直接水解生成烟酸,且反应过程中没有烟酰胺生成.经过反应条件的优化后,确定了这个酶催化水解反应的最适温度为30℃、最适pH=8.0和初始底物质量浓度为8～10 g/L.在这个最优条件下,采用分批补料法可将加入的3-氰基吡啶完全转化为烟酸,此时反应液中烟酸的积累量达到118 g/L,底物和酶的实际质量分数为50:1,产物纯品收率为85%左右.     

林生毛霉对孕甾烯醇酮的生物转化研究

利用林生毛霉对孕甾烯醇酮进行生物转化,得到了三个转化产物。经波谱学方法(IR、MS和2D NMR)分别鉴定为3β,7α-二羟基孕甾-5-烯-20-酮(2)、3β,7α,11α-三羟基孕甾-5-烯-20-酮(3)和3β,7α,9α-三羟基孕甾-5-烯-20-酮(4)。通过2D NMR技术对产物13C NMR数据进行了全归属,详细地解析了化合物4的结构。     

5,6α-环氧-16-孕甾烯酮的生物转化研究

首次以绿色木霉对5,6α-环氧-16-脱氢孕甾酮的生物转化进行了研究,得到了15β羟基化的多羟基甾体新化合物3β,5α,6β,15β-四羟基-16-孕甾烯酮。试验结果表明:以初始pH值6.5的马铃薯汁培养基进行菌种培养,在菌种生长40h后加入0.1%底物,发酵时间为4d,温度27℃,3β,5α,6β,15β-四羟基-16-孕甾烯酮的收率最高。     

螺甾内酯(Spiroenone)中间体的合成

3β-乙酰氧基雄甾-5，15-二烯-17-酮(2)与甲基硫氧叶立德(3)通过亲核加成反应得到螺甾内酯(Spiroenone)重要中间体3β-乙酰氧基-15β，16β-亚甲基雄甾-5-烯-17-酮(1)，产物经重结晶法分离，收率达80．5％．讨论了反应的主要影响因素，找到了优化条件，即反应温度为12℃，n((CH3)3S^ OI^-)：n(NaH)：n(2)=1．1：1．05：l，溶剂为二甲亚砜和四氢呋喃(体积比为4：1)时，加料方式为叶立德溶液加入到甾体溶液中．实验表明：低温有利于15β，16β-亚甲基产物的形成．测试了产物的物理常数；并用IR，MS，^1HNMR等波谱分析手段对产物进行了表征、     

中国南海脆二歧灯芯柳珊瑚Dichotella fragilis(Ridleg)化学成分的研究

以硅胶柱层析、Sephdex LH-20凝胶柱层析及半制备HPLC等层析分离技术,对脆二歧灯芯柳珊瑚Dicho-tella fragilis (Ridleg)的提取物进行分离纯化,并利用NMR、MS等波谱方法分析所得化合物的结构,共分离鉴定出5个化合物,包括3个19-羟基甾体皂苷类化合物junceelloside B (1)、4’-O-Acetyl-3-O-[β-D-arabino-pyranosyl-oxy]-cholest-5-ene-3β,19-diol (2)及junceelloside C (3),以及2个briarane型二萜类化合物junceol E(4)及gemmacolide A(5).以上化合物均为首次从脆二歧灯芯柳珊瑚中分离得到.化学分类学研究表明19-羟基甾体皂苷可作为Dichotella和Junceella属柳珊瑚的标志性次级代谢产物,此二属的柳珊瑚具有很近的亲缘关系.     

β-环糊精及其修饰体用于液相反应综述

β-环糊精修饰体主要分为全取代β-环糊精修饰体和部分取代β-环糊精修饰体2种,β-环糊精修饰体可以用于液相反应的反应模型、液相有机合成反应和液相手性有机合成反应。详细介绍了β-环糊精及其修饰体应用于液相反应研究的最新进展,并对β-环糊精及β-环糊精修饰体的反应底物选择性和催化性能进行阐述。     

近暗散白蚁 β-葡萄糖苷酶RpBgl7的异源表达及酶学性质研究

为研究近暗散白蚁(Reticulitermes perilucifugus)β-葡萄糖苷酶RpBgl7,利用生物信息学分析β-葡萄糖苷酶RpBgl7的家族及结构特点,构建RpBgl7的重组表达载体pCold-TF-RpBgl7,在大肠杆菌中过量表达并纯化,分析其最适反应条件和酶动力学参数。结果表明,RpBgl7属于糖苷水解酶1家族,具有2个保守的谷氨酸催化残基Glu187和Glu394。RpBgl7在BL21(DE3)中过量表达,经过镍离子亲和层析1步纯化可得到高纯度RpBgl7重组蛋白。以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,测得RpBgl7的最适pH值为6.0,最适温度为70℃;动力学参数K_m=0.13 mmol/L,k_(cat)=3.15 s~(-1)。RpBgl7可耐受Na~+、K~+、Mg~(2+)、Cu~(2+)和Ba~(2+),而Ca~(2+)、Hg~(2+)和Fe~(3+)明显抑制RpBgl7的酶活力。     

大鼠甘油醛3 磷酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活动态监测

利用大肠杆菌原核表达系统高效表达大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶,并结合蛋白分离纯化技术获得高纯度样品,动态监测其酶活。通过RT-PCR技术,扩增PC12细胞中甘油醛3-磷酸脱氢酶编码序列并亚克隆到原核表达载体pET28b;鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞并采用诱导剂IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达,表达产物采用15% SDS-PAGE鉴定,用镍柱对蛋白进行纯化及脱盐;最后将分离纯化产物在体外进行甘油醛3-磷酸脱氢酶酶活动态分析。结果表明,成功构建大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶的原核表达载体pET28b-G3PDH;高效表达甘油醛3-磷酸脱氢酶,表达产物占总蛋白35%,且发现表达产物主要以可溶形式分布于裂解上清;制备甘油醛3-磷酸脱氢酶纯品并通过酶活动态扫描显示其具有高效酶活性。通过大肠杆菌原核表达技术高效制备具有重要酶活作用的大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶,为进一步研究其在糖代谢中的功能以及其可能的新功能奠定基础。     

黑刺菝葜中的甾体皂甙研究

从黑刺菝葜 (Smilax scobinicaulis Wringh C.H.)根中首次分离得到 2个甾体皂甙化合物 ,经理化、光谱分析及与标准样品对照 ,鉴定化合物 为拉克索皂甙元 - 3- O- [α- L -吡喃阿拉伯糖基 - (1→ 6 ) ]-β- D-吡喃葡萄糖甙 ,化合物 为拉克索皂甙元 - 3- O- [β- D-吡喃葡萄糖基 - (1→ 4 ) ]- [α- L -吡喃阿拉伯糖基 - (1→ 6 ) ]-β- D-吡喃葡萄糖甙。     

β-actin在小鼠外侧腓肠肌3个亚体中的表达差异

研究成年小鼠后肢外侧腓肠肌的3个肌亚体即内侧亚体、外侧浅亚体、外侧深亚体β-肌动蛋白(β-actin)基因中半定量RT-PCR的表达差异.采用RT-PCR方法分别抽提各个肌亚体的总RNA,逆转录成cDNA,通过PCR扩增,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参,用半定量RT-PCR方法测定成年小鼠β-肌动蛋白基因在3个肌亚体的表达差异.研究结果,β-肌动蛋白主要在外侧腓肠肌内侧亚体表达(0.63),外侧浅亚体较少(0.42),外侧深亚体最少(0.10).     

产酶溶杆菌OH11菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从OH11菌株中克隆到β-1,3-葡聚糖酶基因,通过同源性比较发现其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的β-1,3-葡聚糖酶有90%以上的同源性。该基因经NdeⅠ、XhoⅡ或HindⅢ酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )和载体pET30a( )上构建重组质粒,并分别转化宿主菌BL21(AI)和BL21(DE3)产生表达菌株。表达菌株BLGluA和BLGluC经IPTG诱导后分别产生相对分子量约为29 000(GluA蛋白)和44 000(GluC蛋白)的蛋白。酶活性和抑菌活性测定结果表明,GluA蛋白和GluC蛋白能将海带多糖水解,在海带多糖培养基上产生透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用,具有一定的生物防治作用。     

Alzheimer病神经细胞死亡的分子机制进展

Alzheimer病(AD)是一种神经退行性病变,由于大脑皮质及海马的神经细胞(NC)死亡脱落,引起脑萎缩,记忆和学习能力障碍,出现痴呆症状.AD发生机制复杂,至今仍不十分清楚.从家族性AD(FAD)家系发现的3个致病基因,为突变的β-淀粉样蛋白(Aβ)前体(APP)、早老素1(PS-1)、早老素2(PS-2).在体外细胞系,这些致病基因可诱导或加重细胞死亡.本文以AD致病基因和Aβ引起细胞死亡为中心,简述与AD相关的NC死亡的分子机制研究进展.     

人参皂甙酵母菌中β-半糖甙酶诱导的影响

研究了红参皂甙(总皂甙,皂甙组分Rb1和Rg1)对酵母菌(Saccharomyces cere-visiae)中的β-半乳糖甙酶诱导的影响,认为人参皂甙将穿过细胞膜,在细胞核中起甾体激素作用.为了达到这一目的,把包CALI启动子的EcoR I的DNA片段(685bp)插入到质粒YEp356(7.966kb)的LacZ基因上游的多酶切点,假设由此产生的质粒pGAL1-LacZ在半乳糖存在下仅表达β-半乳糖甙酶.将质粒pGALI-LacZ导入酵母菌KY106(a 1eu2 ura3 his3trpl lys2)中,转化细胞在半乳糖存在下,比在葡萄糖存在下生长得缓慢.检测了皂甙对转化酵母细胞中β-半乳糖甙酶特殊活性的影响.在这种条件下,总皂甙对酶活性没有明显的影响,而皂甙组分Rb1、Rg1对酶活性却有明显地促进作用.最大提高幅度以10%～3%浓度的Rb1为35%,10%～1%的浓度的Rg t为75%.这些数据说明人参皂甙可能会进入到细胞核并刺激转录.但是,要确定这种可能性需要在找出假定皂甙受体的进一步研究.     

多棘海盘车化学成分的分离与鉴定

采用硅胶柱色谱、薄层制备色谱、凝胶柱色谱等手段分离纯化,通过理化常数测定、光谱数据分析和文献对照等方法,对多棘海盘车Asterias amurensis Lutken未被发现的化学成分进行结构鉴定。结果从多棘海盘车中分离得到4种化合物,化合物的结构分别为Phalluside 1(化合物1); N-(胆甾-5-烯-3β-烃基)-3β-醋酸酯-5-乙基-17β-咪唑羧酰胺(化合物2);胆甾-5,20(22)-二烯-3β-醇(化合物3);(2S)-1-O-7溴烷醇甘油(化合物4)。研究表明,化合物1、2、3、4为首次从海盘车属中分离得到的化合物。     

1,3-二取代-2-氧代-3-吲哚乙腈的合成及抑菌活性研究

【目的】寻找具有高抑菌活性的新型化合物。【方法】以3-吲哚乙腈为原料,经过1-位烷基化、2-位氧化和3-位烷基化反应,合成1,3-二取代-2-氧代-3-吲哚乙腈类衍生物,对合成的化合物进行核磁共振谱(1 H NMR、13 C NMR)和低分辨质谱(LC-ESI-MS)分析,并分别测定合成衍生物对5种供试病原真菌(小麦赤霉病菌、茄子黄萎病菌、烟草赤星病菌、番茄灰霉病菌、苹果炭疽病菌)的抑菌活性。【结果】经1 H NMR、13 C NMR和LC-ESI-MS分析确认,成功合成了6个1,3-二取代-2-氧代-3-吲哚乙腈类衍生物(3a~3f)。抑菌活性试验结果表明,6个目标化合物对5种供试病原真菌均有一定的抑菌活性;结构与活性相关分析说明,此类化合物骨架中芳香苄基对抑菌活性的贡献优于脂肪烃基异戊烯基,且芳香苄基中氟原子对化合物的抑菌活性有一定的促进作用,其中1-位和3-位同为对氟苄基的化合物3f(1,3-二对氟苄基-2-氧代-3-吲哚乙腈),对番茄灰霉病菌和烟草赤星病菌均具有较高的抑菌活性,有效中浓(EC50)分别为28.06和31.36μg/mL。【结论】本研究的合成方法简单、高效,合成的化合物3e和3f对5种供试病原真菌的抑菌活性均高于其他化合物,具有进一步研究和开发的价值。