10株广西猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列的遗传变异分析

为了解广西猪群猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,以PCV3阳性DNA为模板,利用PCR的方法分2段扩增PCV3全基因序列并进行拼接,获得10株PCV3全基因组序列,全长均为2 000 bp。10株广西PCV3全基因组序列之间的核苷酸同源性为98.6%～99.8%。与国内其他毒株的同源性为97.9%～99.8%;与国外其他毒株的同源性为98.8%～99.7%。10株广西PCV3 Cap基因的大小均为645 bp,编码214 aa。PCV3 Cap基因比较保守,10株广西PCV3 Cap基因与参考株相比,仅存在散在的突变位点。基于PCV3全基因和Cap基因构建的遗传进化树显示,两者结果基本相同,10株广西PCV3处于3a和3b两个亚群。本试验表明,广西地区猪群中流行的PCV3至少存在2个亚群,不同亚群PCV3毒株的致病性差异还有待进一步的研究。     

广东地区新生仔猪先天性震颤猪群中PCV3感染情况的调查

对广东省不同地区新生仔猪先天性震颤猪群中PCV3的流行病学情况进行调查。采集的病料样品,通过常规PCR进行PCV3检测与全基因扩增,分析其全基因的遗传进化关系。将获得的16株PCV3毒株核酸序列与其他环状病毒参考毒株对全基因组和Cap基因进行遗传变异分析,结果显示,新生仔猪的先天性震颤猪群中PCV3样本总阳性率高达58.2%。16株PCV3毒株之间全基因核苷酸序列同源性为99.5%~100%,与美洲代表毒株PCV3-US/MO2015全基因核苷酸序列同源性在98.8%~99.1%之间;16株PCV3毒株之间Cap基因的核苷酸序列同源性为99.7%~100%,与国内外参考毒株的核苷酸同源性为99.1%~100%。遗传进化分析显示,16株PCV3毒株都属于PCV3a分支。PCV3在我国广东省新生仔猪先天性震颤猪群中广泛存在。     

猪圆环病毒2型Guizhou-LZTQ/2017株全基因组序列分析

为了解贵州省某新建猪场由猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的保育猪咳喘、腹泻死亡的病原中PCV2的基因型和变异情况,采用基因克隆技术,对其全基因进行克隆分析。结果显示,PCV2/Guizhou-LZTQ/2017株全长为1768bp,属PCV2a型,与国内外毒株碱基之间存在多处差异;其ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸与常用疫苗毒株之间同源性在92.2%~93.7%之间,与省内已经报道的PCV2毒株ORF2之间的氨基酸同源性在90.2%~92.7%之间,与4株疫苗株指数差异性较大;全基因遗传进化分析,其与Guangdong株和GZ-CS12012株属同一细分支,亲缘关系最近。研究结果可为后续PCV2分子生物学研究、流行病学调查及疫苗的选用提供基础数据。     

2020年猪圆环病毒2型云南流行株的分子鉴定及全基因组序列分析

为了弄清云南省猪圆环病毒2型(PCV-2)的流行和基因变异情况,试验采用PCR鉴定、PCV-2全基因扩增及克隆、PCV-2蛋白氨基酸比对与遗传进化分析、PCV-2 Cap蛋白氨基酸比对分析、PCV-2 Cap蛋白抗原指数预测分析等方法进行研究。结果表明,从43份样品中检测出5份阳性样品,其阳性率为11.63%;成功获得5个大小为1 768 bp的PCV-2全基因序列,分别将其命名为YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5;获得的5株毒株与国内外毒株氨基酸之间存在差异,同源性在66.8%～99.1%之间;5株PCV-2 ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸与5株疫苗株也存在多处氨基酸变异;其中YN PCV2-4 Cap蛋白抗原指数与5株疫苗株的Cap蛋白抗原指数差异性不大,而YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-5的Cap蛋白抗原指数与5株疫苗株的Cap蛋白抗原指数差异性较大,在5～10,25,40～50,70,172～176,210～223区域的抗原指数均不同于疫苗株。说明云南省流行的猪圆环病...     

北京市猪场猪圆环病毒3型感染状况调查及其ORF2基因遗传进化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在北京市不同区县猪场中的流行情况,研究建立PCR检测方法,对来自北京市8个区县56个养殖场的1177份临床样品进行检测,并对获得的部分ORF2全基因序列进行遗传进化分析。结果显示,PCV3总体阳性率为1.0%(12/1177),猪场阳性率为8.9%(5/56)。对PCV3阳性样本进行ORF2基因测序及同源性比对,共测得12株PCV3 ORF2全长基因序列,其中包括6株不同的ORF2全长基因序列。结果显示,该6株序列之间的核苷酸相似性为97.7%～99.5%,推导氨基酸序列的相似性为97.2%～100%;与参考毒株之间的核苷酸同源性为96.0%～99.5%,推导氨基酸同源性为92.1%～100.0%;进化树显示北京毒株属于PCV3b基因型。试验表明,PCV3在北京多个猪场呈现一定的流行趋势,流行毒株以PCV3b基因型为主。     

山西省猪圆环病毒3型感染调查及其Cap基因的遗传进化分析

为了解山西省各地市养猪场中猪圆环3型病毒(PCV3)的感染及其Cap基因的遗传变异情况,本研究通过PCR方法对2019年6月～7月采集的山西省11地市共521份猪肺脏组织样品进行PCV3检测,结果显示,山西省PCV3的总体感染率高达85.22%(444/521),大同市、长治市、吕梁市、临汾市的阳性检测率高达90%以上,朔州市、太原市的阳性检出率较低为65.38%、64.00%,说明山西省PCV3的感染率总体较高。随机抽取山西省各地市11份PCV3阳性肺脏样品进行Cap基因的PCR扩增并测序,利用DNAStar软件将其与30株PCV3参考株、3株PCV2疫苗株进行同源性及遗传进化分析。Cap基因同源性分析结果显示,11株PCV3间Cap基因的同源性为97.8%～99.5%,与PCV3参考株Cap基因的同源性为97.7%～99.7%;11株PCV3 Cap基因编码氨基酸比对分析结果显示,其与PCV2 Cap蛋白氨基酸序列的同源性为27.1%～29.0%,与PCV3参考株Cap基因编码的氨基酸同源性为97.7%～100%;11株PCV3 Cap基因进化树结果显示,4株PCV3属于PCV3b型,7株PCV3属于PCV3a型;选取的11株病毒与PCV3参考株仅于aa24、aa27、aa77、aa150有散在变异位点,且与3株PCV2疫苗株抗原表位有明显差异,据此分析可知山西省各地市流行的PCV3株同源性及整体保守性均较高。对所有病料样品进行PCV2、PRV等病毒的检测,结果发现PCV3与PCV2的混合感染率为44.53%(232/521),与其他病毒的混合感染率较低。本研究首次对山西省11地市PCV3的感染情况进行了调查,结果表明PCV3感染率较高,该地区流行的PCV3株相对保守,且与PCV2混合感染率较高,上述结果为山西省PCV感染的防控提供了参考依据。     

湖南省10株猪圆环病毒3型的测序与遗传进化分析

为了解湖南省猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,以25份PCV3阳性样品DNA为模板,使用PCR方法分两段扩增PCV3全基因序列并进行拼接。结果获得7株PCV3分离株全基因组,3株PCV3 ORF2序列。7株PCV3全基因组的核苷酸序列同源性为98.8%～99.7%,10株ORF2的核苷酸序列同源性为97.8%～99.8%。根据系统发育树,PCV3可分为3个分支,所有分离株的遗传关系均较近。ORF2氨基酸序列突变少,发现2个在其他参考毒株中未出现的突变位点。研究获得的PCV3毒株序列与国内外PCV3毒株序列其遗传关系较近,无特殊突变,较为稳定。     

猪圆环病毒2型贵州部分流行株的全基因克隆及序列分析

为了调查近几年贵州地区猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的遗传变异趋势,为猪圆环病毒病的有效控制提供参考,利用实验室所建立的多重PCR对贵州不同地区送检的病死仔猪及采集的血样进行检测,并对PCV2核酸进行全基因的扩增,应用生物学软件对PCV2全基因序列进行核苷酸同源性和遗传进化分析。结果:从PCV2检测为阳性的病料中成功扩增出8条PCV2全基因序列,均属于PCV2d基因型。结果表明:近年来贵州地区猪群PCV2d基因型的感染病例增多。研究结果为贵州PCV2疫苗毒株提供了选择依据。     

猪圆环病毒2型青海分离株的分子鉴定及进化分析

本研究对青藏高原地区猪圆环病毒青海分离株(PCV2-QH1)进行了Cap基因的克隆鉴定及测序分析,并与我国及其他国家或地区的毒株进行了同源性比较和遗传进化分析。结果显示:PCV2-Cap基因核苷酸序列全长705 bp,编码蛋白为234个氨基酸,分子量大小约28.06 k Da,为不稳定蛋白,总体亲水性非常高,可溶于水;PCV2-Cap蛋白二级结构以无规则卷曲为主,有多个有效的抗原表位;PCV2-QH1分离株与其他参考序列的核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上;PCV2-QH1分离株与PCV2美国分离株(KU697156)组成一个微小分支,并与美国毒株、韩国毒株聚在一支,表明它们之间的亲缘关系最近。本次对青海分离株PCV2-QH1的鉴定,可为我国猪圆环病毒分子流行病学调查提供数据参考。     

吉林省猪圆环病毒3型的分子流行病学调查及遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在吉林省的流行情况和分子生物学特性,本研究通过PCR方法对吉林省2015-2017年的484份血清样品进行PCV3检测,将PCV3检测阳性的样品进行ORF2基因扩增和测序,并利用生物信息学软件DNAStar和Mega 6.06对ORF2基因的分子生物学特性进行分析。结果显示,吉林省2015-2017年PCV3样品总感染率和猪场感染率分别为28.1%(136/484)和65.8%(25/38),且呈逐年上升趋势。同源性分析结果表明,本研究获得的4株PCV3 ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.3%～98.9%和97.7%～99.5%,4株PCV3 ORF2基因与国内外参考毒株ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.7%～99.7%和96.7%～100%。遗传进化分析表明,PCV3存在2个亚群:PCV3a和PCV3b。本试验分离的PCV3毒株分别位于2个亚群上,1株属于PCV3a亚群,3株属于PCV3b亚群。PCV3毒株Cap蛋白第24(A、V)和27位(R、K)氨基酸的不同可能与PCV3毒株的进化相关。本试验结果表明,PCV3在吉林省猪群和猪场中存在很高的感染率,PCV3毒株之间高度保守,本研究结果为PCV3的分子特性研究提供了参考依据。     

福建省新发猪圆环病毒3型分子流行病学调查及其Cap基因分子特征

为了解2015―2017年福建省新发猪圆环病毒3型(PCV3)的流行现状、分子生物学特征和遗传演化规律,收集福建省不同地区186个猪场的267份疑似PCV3感染猪的组织病料进行分子流行病学调查,并对其Cap基因进行了遗传变异分析。结果显示,福建地区PCV3猪场总阳性率为30.11%,疑似样品总阳性率为21.72%,且呈逐年增高的趋势;17株PCV3福建分离株与其他17株国内外参考毒株Cap基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性较高,分别为96.0%～100.0%和96.3%～100.0%,表明这些毒株可能有相同的进化来源;氨基酸多序列比对发现,Cap基因氨基酸序列最有特征性的是第168位(R→K)和173位(L→F)的氨基酸替换,该位点的突变可能是该地区流行的PCV3毒株的一个重要分子特征;同时,抗原性分析发现第173位(L→F)的突变还位于Cap蛋白的抗原表位区内。遗传进化树分析结果表明,17株PCV3福建分离株中有2株属于3a亚型,其余15株属于3b亚型,表明当前福建地区PCV3流行毒株主要为3b亚型。     

吉林省猪圆环病毒3型的分子流行病学调查及遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在吉林省的流行情况和分子生物学特性,本研究通过PCR方法对吉林省2015-2017年的484份血清样品进行PCV3检测,将PCV3检测阳性的样品进行ORF2基因扩增和测序,并利用生物信息学软件DNAStar和Mega 6.06对ORF2基因的分子生物学特性进行分析。结果显示,吉林省2015-2017年PCV3样品总感染率和猪场感染率分别为28.1%(136/484)和65.8%(25/38),且呈逐年上升趋势。同源性分析结果表明,本研究获得的4株PCV3 ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.3%～98.9%和97.7%～99.5%,4株PCV3 ORF2基因与国内外参考毒株ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.7%～99.7%和96.7%～100%。遗传进化分析表明,PCV3存在2个亚群:PCV3a和PCV3b。本试验分离的PCV3毒株分别位于2个亚群上,1株属于PCV3a亚群,3株属于PCV3b亚群。PCV3毒株Cap蛋白第24(A、V)和27位(R、K)氨基酸的不同可能与PCV3毒株的进化相关。本试验结果表明,PCV3在吉林省猪群和猪场中存在很高的感染率,PCV3毒株之间高度保守,本研究结果为PCV3的分子特性研究提供了参考依据。     

猪圆环病毒2型乌鲁木齐分离株全基因序列遗传变异分析

为分析乌鲁木齐市猪圆环病毒2型(PCV2)遗传变异情况,对疑似感染PCV2组织样品的全基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并进行序列比对与遗传进化分析。结果表明,测序的5株PCV2基因组3株全长为1 766 bp,2株全长为1 767 bp,5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%~99.5%之间,与Gen Bank国内外已发表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%~99.7%之间;遗传进化树显示,3株属于新出现的PCV2d亚型毒株,2株属于国内优势流行的PCV2b亚型毒株。     

猪圆环病毒3型全基因克隆及遗传演化分析

辽宁地区某猪场发现疑似断奶仔猪多系统综合征(PMWS),经临床症状、病理变化和PCR检测,确诊为猪圆环病毒3型(PCV3)感染;根据Gen Bank中收录的PCV3基因序列,设计2对特异性引物,从患有PMWS的仔猪内脏组织中扩增PCV3全基因序列,克隆到p MD18-T载体中,经测序、拼接获得PCV3全长c DNA序列,利用DNAStar和DNAman生物软件对全基因组进行遗传变异分析。结果显示:PCV3毒株基因组全长2 000 bp,命名为CN/Liaoning-2017 (简称LN株)(GenBank登录号:MH177453. 1),基因组有3个开放阅读框(ORF),其中2个ORF编码的蛋白与圆环病毒的复制相关蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)同源。Cap基因大小为645 bp,编码214个氨基酸。PCV3国内株可分为3大分支(3a簇、3b簇与3c簇),LN株处于3a簇分支中,与湖北株(KY354039. 1)同源性最高,达到99. 7%; LN株与PCV3a簇代表株(PCV3-USMN2016,PCV3-US-MO2015)同源性在98. 8%～99. 2%之间,与PCV3b簇代表株(PCV3-US-SD2016)的同源性为98. 8%,与PCV3c簇代表株(PCV3-China-GD-2016)同源性为98. 7%。Cap蛋白氨基酸位点分析显示,LN株在第68位发生突变,与其他代表株都不相同。以上试验结果表明,成功从患有PMWS的仔猪体内克隆了PCV3全基因,并完成了序列分析。LN株是辽宁省首次发现的PCV3毒株,这些数据将为研究PCV3的遗传变异和流行病学特征提供分子生物学依据。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767bp,10株为1 768bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株(10084F4、R14040及R14086)的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

猪圆环病毒3型的检测及其全基因进化分析

本研究对2016年3月~2017年3月采集于上海市猪场的20份病料进行了病原体检测,并对检测到的圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)进行了全基因分析。检测结果显示:猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)阳性病料1份,而猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)均为阴性;PCV3阳性病料2份,其中1份为PCV3和PRRSV混合感染。对这2株PCV3进行全基因测序和Blast分析,并绘制PCV3全基因、囊膜蛋白基因的遗传进化树,结果显示:与这2株病毒基因同源性最高的毒株为CN/Hubei-618/2016,同源性为99%;在全基因进化树中,这2株毒株和中国来源的PCV3毒株以及美国毒株PCV3/USA/MO2015(Gen Bank登录号:KX778720.1)在同一群中;在囊膜蛋白基因的进化树中,这2株PCV3属于PCV3a。     

2019年我国部分地区鸭圆环病毒基因序列测定与分析研究

为了解近年鸭圆环病毒流行毒株的基因遗传特点和变异情况,通过采用PCR的方法对我国部分地区的30份鸭圆环病毒阳性样品进行全基因组扩增与克隆、序列测定及遗传进化分析。结果显示:30株DuCV流行毒株之间的全基因序列同源性为85.8%~99.9%,其中26株DuCV的全基因序列长为1993~1995 bp,与德国代表株处于同一进化分支,属于基因1型,4株DuCV的全基因序列仅有1988 bp,与中国台湾代表株属于同一进化分支,属于基因2型;Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列的变异分析表明Cap蛋白的变异程度要显著高于Rep蛋白。     

PCV3吉林野毒株全基因组序列分析及其Cap蛋白的亚细胞定位

为了研究吉林省猪圆环病毒3型(PCV3)野毒株遗传变异情况及其衣壳蛋白(Cap)的亚细胞定位特征，本试验对收集到的10株PCV3吉林野毒株进行全基因组序列测定和分析，并构建真核表达载体pcDNA3.1V5/HisA-Cap转染猪肺巨噬细胞(PAM);继而用本实验室已构建的兔源PCV3-Cap多克隆抗体，通过激光共聚焦检测Cap蛋白在PAM中的定位。序列分析结果显示，10株PCV3吉林野毒株与国内外参考株之间的全基因组核苷酸序列同源性为95.8%～99.5%,处于PCV3a和PCV3b两个亚群；基因重组分析结果显示，仅中国参考株MF589102(2016年)、MH445396(2019年)和分离株JL-2在80～303 nt、840～1 196 nt和1 885～2 001 nt处发生3处重组。激光共聚焦检测结果显示，Cap蛋白大部分定位于细胞核，少部分定位于细胞质。结果表明，目前吉林省PCV3比较保守，没有出现较大变异，Cap蛋白在PAM的细胞核和细胞质中均有分布。     

5株湖南猪圆环病毒1型全基因组测序与遗传进化分析

为了解湖南猪群猪圆环病毒1型（PCV1）的遗传变异情况,以PCV1阳性DNA为模板,使用PCR方法分两段扩增PCV1全基因序列并进行拼接。结果共获得5个PCV1全基因组,其中3株全基因大小为1 759 bp,另外2株分别为1 758 bp和1 760 bp。5株全基因组同源性为98.4%~99.7%,与国内外的PCV1全基因组同源性为98.1%~99.7%;ORF2序列同源性为97.6%~99.6%,与国内外的PCV1 ORF2同源性为96.1%~99.9%。系统发育树显示,5株PCV1均属于同一分支,并显示出一定的地理差异,但差异较小。结果表明,湖南省流行的PCV1毒株基因较为稳定,分离株间差异较小。本研究为湖南省猪圆环病毒病防控及相关研究奠定了基础。