A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别检测A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对SVA 3D基因与O型、A型、亚洲I型FMDV VP1基因,分别设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同时检测SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法.所建立的方法能特异性扩...     

不同血清型的口蹄疫病毒的特征

<正>不同血清型的口蹄疫病毒的整个基因组的核苷酸序列平均有86%的同源性,但VP1编码区变异性最大,只有约50%~70%的同源性。血清型O、A、C和亚洲1型口蹄疫病毒在VP1编码序列上的变异性更大,同源性最高只能达到15%。因此,O型口蹄疫病毒以VP1编码序列的不同为基础,将世界各地的FMDV分为八个,在基因和地理上不同的基因型称为拓扑型。这八型分别是中东、     

A型口蹄疫病毒VP1基因序列的基因分型研究

为设计A型FMDV基因分型探针建立其3个基因型的数据库,以美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库和英国口蹄疫世界参考实验室(FMDWRL)基因库中所登记的血清A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因序列为研究对象,运用双序列比对和构建系统发育树的方法对未知基因型的VP1序列进行基因分型并比较两种方法的分型结果。结果表明,两种分型方法的分型率均达到92%,分型结果基本一致。运用这两种方法都可实现对A型FMDV VP1序列的基因分型。     

O型、A型及Asia1型3个型口蹄疫病毒通用套式RT-PCR检测方法的建立

为了建立针对流行于我国及周边国家主要口蹄疫病毒(FMDV)血清型的检测方法,本实验设计2对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时扩增O型、A型及Asia1型FMDV VP1全基因的套式RT-PCR (RT-nPCR)方法.该方法能特异性检测O型、A型和Asia1型FMDV,对其它相关动物病毒的检测结果均为阴性;比FMDV多重RT-PCR商品试剂盒敏感约1 000倍.利用该方法对10份FMDV样品进行扩增检测,结合扩增产物的克隆测序技术,对所检样品进行了准确定型.实验结果表明,该方法通用型强,可用于3个血清型FMDV的检测和分子流行病学调查.     

O型和Asia1型口蹄疫病毒感染RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank中O型和Asia1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的vp3、vp1和2A基因序列,并与其它血清型FMDV的对应基因序列进行比较,设计用于扩增O型和Asia1型FMDV vp1基因的特异性引物,建立O型和Asia1型FMDV RT-PCR鉴别诊断方法。本方法首先用通用型引物进行RT-PCR,确定是否为FMDV感染,然后用特异性引物鉴别O型或Asia1型FMDV的感染。用vp1基因序列分析进行符合性试验,验证了该方法所具有的特异性和敏感性。本方法可用于O型和Asia1型FMD的快速诊断及流行病学调查。     

应用荧光RT-PCR检测亚欧型口蹄疫病毒

根据口蹄疫病毒基因组的5’非翻译区序列比较保守的特点,采用软件设计亚欧型(A、O、C及Asia-1型)FMDV通用的引物和探针,经对反应条件和反应体系进行优化,建立了亚欧型FMDV的实时荧光RT-PCR检测方法。研究表明,该方法检测阳性质粒模板的线性范围为1.9×107-1.9×10拷贝,最低可检测19个拷贝。通过对FMDV各血清型(A、O、C、Asia-1及SAT-1,2,3型)的检测,证实该方法对亚欧型FMDV具有良好的特异性,能有效区分亚欧型和南非型FMDV感染。本研究为亚欧型口蹄疫的快速诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

口蹄疫病毒RT-PCR检测与血清型鉴别

针对编码非结构蛋白的3D基因合成一对引物进行口蹄疫病毒RT-PCR扩增,不同血清型病毒的RNA样本均显现一条457bp的目的带,与预期设计的长度相符合。在敏感性试验中,O型、A型和AsiaⅠ型病毒的最小RNA检出量分别为0.8ng、8ng和8ng。根据GenBank发表的口蹄疫病毒VP1和2A基因序列,采用多重RT-PCR鉴别口蹄疫病毒血清型,O型、A型和AsiaⅠ型病毒的特异性扩增片段分别为200bp、340bp和500bp。对9份乳鼠感染病料进行检测,确诊为O血清型口蹄疫病毒感染。     

5株口蹄疫病毒VP1和3A基因的序列分析

为了解广东地区口蹄疫病毒(FMDV)遗传进化情况,本研究从广东采集5份疑似FMDV感染病料,对样品进行RT-PCR扩增,经克隆测序后,对FMDVs基因序列比对和遗传进化分析。鉴定结果显示,这些病料样品中2份为O型FMDV感染,3份为A型FMDV感染。2个FMDV O型样品中VP1基因的全长均为639 bp,编码213个氨基酸,3A基因的全长均为459 bp,编码153个氨基酸;3个FMDV A型样品中VP1基因的全长均为636 bp,编码212个氨基酸。3A基因的全长均为459 bp,编码153个氨基酸;与国内外分离的O/A型病毒株VP1基因核苷酸序列相比较发现,2个O型病毒VP1基因与O/BY/CHA/2010株核苷酸序列相似性最高(95.0%),均属于耿马谱系FMDV(属ESA基因型);3个A型病毒VP1基因与A/GDMM/CHA/2013株核苷酸序列相似性最高(99.2%),均属于Asia型FMDV。本研究通过对FMDV遗传进化分析为我国FMDV流行病学的研究提供了基础数据,同时对临床上不同型疫苗的选择提供依据。     

应用荧光RT-PGR检测亚欧型口蹄疫病毒

根据口蹄疫病毒基因组的5’非翻译区序列比较保守的特点,采用软件设计亚欧型（A、O、C及Asia-1型）FMDV通用的引物和探针,经对反应条件和反应体系进行优化,建立了亚欧型FMDV的实时荧光RT—PCR检测方法。研究表明,该方法检测阳性质粒模板的线性范围为1．9&#215;10^7-1．9&#215;10拷贝,最低可检测19个拷贝。通过对FMDV各血清型（A、O、C、Asia-1及SAT-1,2,3型）的检测,证实该方法对亚欧型FMDV具有良好的特异性,能有效区分亚欧型和南非型FMDV感染。本研究为亚欧型口蹄疫的快速诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

A型塞尼卡病毒与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经优化引物浓度、退火温度等反应条件,初步建立了同时检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV的多重RT-PCR方法。利用该方法同时检测SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型(PCV2)、PCV3等主要猪源病毒,结果显示该方法仅对SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV检测为阳性,其他均为阴性,特异性较强;SVA、O型、亚洲I型、A型FMDV重组质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的多重RT-PCR方法检测,结果显示同一反应体系中,4种重组质粒标准品的检出下限均为2.5×10~2拷贝/μL,敏感性较高;批内、批间重复性试验结果一致,该方法重复性较好。利用本实验建立的方法对2019年采集自广西省的30份临床疑似样品进行检测,结果显示,SVA、O型FMDV的阳性检出率分别为16.67%和63.33%;未检出亚洲I型及A型FMDV;同时采用国家标准《口蹄疫诊断技术》(GB/T18935-2003)中RT-PCR方法以及文献报道的SVA套式RTPCR方法对FMDV、SVA检测,结果与本实验建立的多重RT-PCR方法检测结果的符合率为100%。本研究首次建立的多重RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为鉴别检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV提供了有效的技术方法。     

云南边境O型口蹄疫监测及病毒VP1基因序列分析

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的主要侵袭偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病。口蹄疫病毒为微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员,存在7个不同血清型,病毒VP1蛋白抗原性差异是病毒血清型划分依据,而其编码基因(1D)核苷酸序列差异是同型病毒拓扑型(Topotype)或基因型鉴别依据。采用O/A/C/Asia-1多重RT-PCR技术,对2006年自云南边境地区采集的120份动物组织样品,进行口蹄疫病原监测,检出O型口蹄疫病毒阳性样品15份。对阳性样品中病毒VP1基因全序列进行扩增、纯化后,克隆至pMD18-T载体测序,并与已知代表性毒株进行比对及系统发育分析。结果发现:云南边境O型口蹄疫病毒阳性样品VP1基因核苷酸序列同源性介于77.3%~98.7%,可划分为3个不同的拓扑型或基因型:中东-南亚型(ME-SA)或泛亚型(PAN-Asia)、古典中国型(Cathay)、东南亚型(SEA)。部分样品VP1蛋白表位43位、154位关键性氨基酸位点存在变异。     

O型口蹄疫病毒VP1基因区序列系统发育树分型

从GenBank和世界口蹄疫参考实验室基因库(WRLFMD)下载O型FMDV全VP1序列共210条,其中23条为已知基因型序列,其他为未知基因型序列.利用分子生物学软件DNA Star中的ClustalW和TreeView工具,以已知基因型的VP1区序列构建系统发育树,验证分型结果与已知基因型是否一致.然后以已知基因型序列作为参照,将未知基因型序列与已知基因型序列一起构建系统发育树,以已知基因型序列在系统发育树中所处的位置,来判断未知基因型序列的归属,从而明确它们归属于何种基因型.结果表明,采用此种分型方法获得Cathay型74条、SEA型24条、EA型4条、WA型4条、Euro-SA型21条、ME-SA型68条、ISA-1型3条、ISA-2型2条,未能分型序列10条.     

Detection of Foot and Mouth Disease and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viral Genes Using Microarray Chip

Two viral pathogens, namely, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and foot and mouth disease virus (FMDV), were selected as models for multiple pathogen detection in a cDNA microarray. Two signature regions selected from ORF2 (around 500 bp) and ORF5 (around 600 bp) of PRRVS (America serotype), and one signature region from structural genes VP1 (around 500 bp) of FMDV type O were designed and spotted on a nylon membrane. For PCR sensitivity study, the cloned FMDV–VP1 template could be diluted to near one copy and its PCR product was still detectable in gel electrophoresis. In the microarray detection, the labelling FMDV probes (3 mg/ml) could be diluted 320 times and still maintained a visible colour when hybridized with the chip. Using the mixing primers, the microarray chip demonstrated rapid and accurate detection of the specific genes. To our knowledge, this preliminary study is the first example reported applying the long signature sequences to the multiple pathogen detection in cDNA microarray.     

Construction of a multiple targeting RNAi plasmid that inhibits target gene expression and FMDV replication in BHK-21 cells and suckling mice

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious disease that afflicts cloven-hoofed animals. The etiological agent of FMD is foot-and-mouth disease virus (FMDV). The VP1 gene of FMDV is essential during the life cycle of the virus and plays a key role in the attachment of the virus to susceptible cells. We constructed a plasmid, pCWN11, that expresses siRNAs multiple-targeting the VP1 genes of FMDV. We evaluated the gene silencing efficiency of the plasmid using an enhanced green fluorescent protein (EGFP) reporter system in BHK-21 cells. The antiviral potential of the plasmid in BHK-21 cells and suckling mice were investigated. The results indicate that cotransfection of pCWN11 with any one of three serotypes VP1-EGFP plasmids resulted in a reduction in the EGFP signal relative to the control. Moreover, the antiviral potential induced by pCWN11 was evident during challenge with one FMDV isolate of either serotype O (HKN/2002) or serotype Asia I (YNBS/58), and the inhibition extended to almost 40 h. Furthermore, subcutaneous injection of pCWN11 in the neck made suckling mice significantly less susceptible to FMDV serotype O and Asia I.     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达载体构建

用Trizol提取O型口蹄疫病毒RNA,根据已经公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对VP1基因的引物,通过RT-PCR扩增出VP1基因,将其克隆至表达载体pET-32a中。经测序表明,目的基因VP1已正确地整合至表达质粒中。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究

利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体,特异性试验表明其只与O、A、Asia 1型3种血清型FMDV抗原结合。进而采用胶体金标记技术,以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克隆血清抗体和葡萄球菌A蛋白为主要材料,研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测O、A、Asia 1型3种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性,检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性,试验结果与口蹄疫实时荧光定量RT-PCR方法的完全一致,表明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是,试纸条的检测极限为1∶160稀释的样品,其敏感性相当于实时荧光定量RT-PCR方法的1/64。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点,因此该试纸条可以用于大量临床样品的快速检测和现场检测。