山葡萄F3’5’H基因的克隆与表达及其启动子5′端缺失片段的功能分析

通过克隆山葡萄（Vitis amurensis）类黄酮-3’5’-羟化酶（flavonoid-3’,5’-hydroxylase,F3’5’H）基因及其启动子,并进行基因的原核表达和启动子不同缺失片段的瞬时表达,研究山葡萄不同种类花色苷的形成机制。克隆得到F3’5’H基因全长1 527bp,分析其理化性质发现,‘双红’品种F3’5’H较‘双丰’品种有所差异,通过对F3’5’H重组蛋白体外表达条件的探究,在温度为25℃、培养时间为11h且IPTG浓度为0.8mmol·L-1的条件下,目的蛋白在上清样品中有与预测重组蛋白分子量大小一致且较高浓度的表达带。山葡萄F3’5’H基因启动子序列共1 271bp,启动子序列中除具有核心启动子元件CAAT-box和TATA-box外,还有一系列光响应元件。采用启动子缺失技术研究不同长度缺失片段启动子在烟草中的瞬时表达,发现随着F3’5’H启动子缺失片段长度的增加,GUS酶活性呈先上升后下降的趋势。     

盐芥ThNHX1基因的3’RACE

以盐芥为材料，依据拟南芥AtNHX1基因的序列信息设计引物，扩增出盐芥中ThNHX1基因的部分序列，然后使用快速扩增cDNA3’末端（3’RACE）方法，从盐芥中克隆到ThNHX13’cDNA序列。该序列全长680bp，编码104个氨基酸，其编码序列、氨基酸序列与拟南芥AtNHX1基因的相应序列同源性分别为91％和91．5％，而盐芥ThNHX1基因3’端非翻译区序列与拟南芥相应序列的同源性为68．5％，明显低于编码区。     

芒果(Mangifera indica)F3’H基因的克隆及其表达分析

花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,而类黄酮3’羟化酶(F3’H)基因是花色素苷合成的一个关键酶,其参与决定了花色、果实颜色、种皮颜色、茎叶表面等花色素苷的生物合成。本研究根据已经报道的F3’H基因的序列设计兼并引物,采用3’RACE和5’RACE方法,克隆得到了芒果果实F3’H基因的全长c DNA序列为1782 bp。该基因开放阅读框为1548 bp,编码515个氨基酸,分子重量为57.44 k D。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与西洋梨、草莓、大豆等具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的F3’H基因的表达进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。     

斑鳜胃蛋白酶原C及其5'侧翼区的克隆及序列特征分析

采用RT—PCR和RACE等技术克隆了斑鳜（Sinipercascherzeri）胃蛋白酶原C（pepsinogenC,PGC）的cDNA全长和部分DNA序列,结果表明：PGCcDNA序列全长1505bp,5’端非翻译区37bp,3’端非翻译区304bp,开放阅读框架（ORF）1164bp,共编码含有387个氨基酸的蛋白质,包括由16个氨基酸组成的信号肽、39个氨基酸的激活肽和332个氨基酸的成熟肽。斑鳜PGC氨基酸序列与斜带石斑鱼、伯氏豚虾虎鱼、狼鲈、美洲红点鲑4种鱼的相似度分别为92．0％、91．5％、90．2％、89．1％,与非洲爪蟾、鸡、人、兔、褐家鼠的序列相似度分别为76．8％、72．8％、72．5％、69．9％、67．3％,表明PGC基因在长期的进化中较为保守。PGC基因由9个外显子和8个内含子组成,内含子剪切位点符合GT—AG规则,在第7含子中发现（GACA）6、（CA）6类型的微卫星序列,第8内含子中发现（TG）,类型的微卫星序列。采用锚定PCR方法获得了PGC5’侧翼区长1924bp的序列,启动子区域位于-40～＋10bp,包含TATA盒以及GATA-1、CdxA、Hand1／E47、AP-1、Nkx-2、S8、FOX J2等转录因子的结合位点。结果为进一步研究该基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础。     

双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereisvirens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereisaibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1857bp,5’端非翻译区为186bp,3’端非翻译区为225bp,阅读框为1446bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTr。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereisvirens CYP4BB1、CYP342A1（AY453408）氨基酸同源性为73％、36％,与多毛类小头虫CapiteUacapitataCYP4ATI（AY574044）同源性为39％。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

山葡萄黄烷酮3-羟化酶VamF3H基因及其克隆

采用RT-PCR与RACE技术相结合的方法,从山葡萄果皮中克隆到黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的c DNA全长序列。该基因全长1 398 bp,包含1 092 bp的完整开放阅读框,编码363个氨基酸,相对分子质量为40.81 ku,等电点(PI)值为5.37。二级结构预测表明,随机卷曲是Vam F3H蛋白最大量的结构元件,不具有信号肽,属于不稳定亲水蛋白。氨基酸序列与欧亚种葡萄(FQ389950)、圆叶葡萄(KF040970)、美国蔓藤(JX087441)等的F3H类基因同源性较高,相似性分别为99%、99%、96%。     

茶树类黄酮3’,5’-羟化酶在大肠杆菌的表达和优化

儿茶素是茶叶主要特征和功能成分之一,其中B环三羟基儿茶素约占儿茶素总量的65%以上。类黄酮3’,5’-羟化酶是类黄酮合成中B环5’羟基化的唯一酶系,与B环三羟基儿茶素合成积累密切相关。采用RACE技术,克隆了茶树类黄酮3’,5’-羟化酶基因的1 944 bp的全长序列,开放阅读框区域为55～1 587 bp,编码510个氨基酸,推测其分子量为57.1 kDa,等电点为9.06。该基因重组至pET-32a(+)表达载体上,在大肠杆菌Rosetta中进行原核表达;优化了原核表达中温度诱导条件;利用钴离子吸附柱纯化了目的蛋白。该研究为开展F3’5’H酶的反应动力学、酶的器官组织定位等研究奠定了基础。     

球毛壳菌二烯醇内酯水解酶基因克隆及序列分析

以球毛壳茵cDNA文库中获得的二烯醇内酯水解酶基因片段(GenBank Accn：BP099060)为基础,用RACE技术克隆出该基因的全长cDNA序列。序列长919bp,由450bp的3’RACE产物和608bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框762bp,编码253个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为27．5kD,理论等电点为5．98。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成,外显子与内含子剪连接区符合AG—GT规则。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY465528,AY555772,AAS66899)。     

鹅催乳素受体基因cDNA2种新5＇-UTR特征分析

应用5＇-RACE技术,在成年雄鹅睾丸中克隆到长度分别为361bp、499bp和594bp3种催乳素受体基因（gPRLR）cDNA5’-端片段,表明雄鹅睾丸至少表达3种gPRLR mRNA。3种5’-端序列含有长度分别为210bp、348bp及443bp的不同5’UTR。3种5’-端序列后195个核苷酸一致,与鸡催乳素受体基因（cPRLR）cDNA第3和第4a外显子高度同源。3种5’-端序列起始密码子ATG均位于第3外显子45—47bp处,与cPRLR cDNA起始密码子同一位置。348bp与443 bp 5＇-UTR结构相似。348 bp 5＇-UTR中,第3外显子上游依次是235bp和69bp,其中69bp与cPRLReDNA第2外显子高度同源。443bp 5’-UTR比348 bp 5’-UTR多插在235bp和69bp之间的95bp。这些结果表明,含348bp和443bp 5’-UTR的mRNA来源于同一初级转录本转录后的选择性剪接。与348bp和443bp 5’-UTR不同的是210bp 5’-UTR在第3外显子的上游含有一个不同的166bp序列。这表明含210bp 5’-UTR的mRNA来源于另一初级转录本348bp 5’-UTR或443bp 5’-UTRmRNA。     

非洲紫罗兰花瓣细胞pH值测定及F3‘5’H基因片段克隆

以白色和蓝色品种的非洲紫罗兰舌状花瓣为材料,测定其细胞液pH值,并利用RT-PCR技术,以NCBI上登记的马铃薯、矮牵牛、龙胆草、金鱼草和瓜叶菊的F3‘5＇H基因片段保守区域为模板,克隆乃芍,爿基因片段,为花色显色机理研究提供理论依据。实验结果表明：蓝色品种非洲紫罗兰细胞液的pH值大于白色品种非洲紫罗兰花瓣细胞液的pH值,随着花期的延长,两个品种非洲紫罗兰细胞液的pH值变化不断增大,且白色品种非洲紫罗兰花瓣细胞液的pH值变化大于蓝色品种非洲紫罗兰花瓣细胞液的pH值;其范围均在3．0-7．0之间,呈弱酸;在两种花色品种非洲紫罗兰中,都得到了F3‘5＇H基因片段的cDNA序列长度为392bp,与马铃薯、矮牵牛、龙胆草、金鱼草和瓜叶菊的F3‘5＇H基因保守区域片段的同源性分别为63．O％、55．4％、52．8％、49．0％和47．7％。     

多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及分析

以盐胁迫处理的多枝赖草(Leymus multicaulis)植株新鲜叶片为材料,根据其他植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT—PCR扩增到1个408 bp的cDNA片段(Genbank注册号为 AY781786);利用DNAMAN软件将5’和3’RACE获得的5’和3’端序列,拼接成1个全长1 580 bp的cDNA序列,其包含1个1 140 bp的开放阅读框架,该阅读框架编码380个氨基酸;多枝赖草谷胱甘肽还原酶氨基酸序列与其他植物的同源性为77％～92％,定量PCR结果表明,GR基因的表达随着盐胁迫时间和盐浓度的增加而加强。     

紫色甘薯渝紫薯7号黄烷酮3-羟化酶基因的克隆和序列分析

为渝紫薯7号品种后续的遗传转化及其分子育种提供理论基础,采用同源克隆和RACE方法对其生物合成途径中关键酶基因进行同源性克隆及生物信息学分析。结果表明:从渝紫薯7号中克隆到F3H基因的全长c DNA序列(Genbank登录号为KU144881),序列全长为1280 bp,包括5’端UTR+一个编码368个氨基酸残基的编码区+3’端UTR+poly A尾巴;F3H基因蛋白具有结合酮戊二酸的RXS基序Arg287-Ser285和结合亚铁离子的保守氨基酸His219、Aps221和His277,结构域位于蛋白的核心(Fe2+被包埋在酶的中心);在Gen Bank中,渝紫薯7号F3H的序列与圆叶牵牛的F3H序列之间具有很高的相似性,为96%;渝紫薯7号F3H蛋白与近缘物种茑萝氨基酸相似性较高,为94%;渝紫薯7号F3H符合植物中普遍存在的F3H基因,同时具有生物学活性。     

水稻类黄酮3'-羟化酶基因克隆及植物表达载体的构建

参考GenBank中发布的水稻品种日本晴位于10号染色体的F3’H基因序列设计特异引物,用PCR方法从水稻基因组中克隆F3’H基因片段,并将该片段克隆到pMD18-T载体进行测序和序列分析。结果表明,克隆的F3’H基因全长1 789 bp,GenBank登录号为HQ876708,该基因与日本晴基因组序列同源性为100%。分别将F3’H基因插入植物双元表达载体pPZP2Ha3(-)和pPZP2Ha3(+)中,获得F3’H基因正义和反义植物表达载体,同时转入根癌农杆菌中。该研究为利用农杆菌介导法转化F3’H基因,进一步研究F3’H基因功能奠定基础。     

甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建

[目的]克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础.[方法]通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA.扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用NotⅠ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体.[结果]通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5 ＇端UTR长度59 bp,3 ＇端UTR长度292 bp,开放阅读框（ORF）长度2895 bp,带有真核生物典型的poly（A）尾巴（GenBank登录号：HQ117935）.该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0％、98.9％和90.0％.构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri.[结论]成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础.     

毛白杨木质素合成酶基因F5H克隆与生物信息学分析

克隆毛白杨阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)基因全长序列,并通过生物信息学分析,为进一步研究F5H基因功能提供基础.利用RT-PCR方法成功从毛白杨741组培苗叶片中克隆了F5H基因,并对F5H基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,包括疏水性-亲水性、氨基酸翻译后修饰、亚细胞定位、跨膜结构域、蛋白质二级三级功能结构域等进行分析预测和推断.获得的基因长度为l 686 bp,编码区1542 bp,与已公布的毛果杨F5H mRNA序列(GenBank登录号为AJ010324)的编码区相似性达97.45％,并与其他植物的该基因序列具有同源性.F5H是亲水性较强的蛋白,整条肽链有1个跨膜结构域;通过亚细胞定位表明F5H主要位于质体中,并含有磷酸化位点有19个.F5H含有丰富的二级结构,卷曲占44.44％、折叠占7.02％、螺旋占48.54％,并预测了其三维结构.分析结果显示,植物的阿魏酸-5-羟基化酶是一个具有跨膜结构域的亲水性蛋白,在内质网等分泌途径中表达.     

罗非鱼免疫球蛋白（IgM）重链基因全长cDNA序列分析

从已经构建的罗非鱼白细胞cDNA文库中测定获得罗非鱼免疫球蛋白（IgM）重链的eDNA序列,全长1885bp,有一个完整ORF阅读框长1770bp,5’UTR为29bp,3’-UTR为86bp,编码588个氨基酸。罗非鱼与大黄鱼、斜带石斑鱼、南极鳕鱼、乌鳢、鳜鱼、伯氏豚[鱼叚]虎鱼、牙鲆、花狼鱼、硬头鳟的IgM重链氨基酸序列有较高的同源性,最高达到69％,表明已经获得罗非鱼IgM重链基因;对所得氨基酸进行二级结构预测发现,罗非鱼IgM重链基因全长cDNA序列所编码的氨基酸分子量为41453．94Da。该试验结果为罗非鱼IgM重链基因功能的实验性鉴定工作奠定了基础。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。     

草菇Volvariella volvacea中乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶编码基因vv-pyrG的克隆和序列分析

运用简并PCR和基因组步行技术克隆常见食用菌草菇的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶编码基因（vv-pyrG基因）,并运用生物信息学和系统发育学的方法对所获得的基因进行了序列分析。结果显示：vv-pyrG基因的编码区长度为920bp,含有2个长度分别为65bp和54bp的内含子,可以编码1个含有266个氨基酸残基的蛋白质序列。该氨基酸序列经比对分析,显示与裂褶菌（Schizophyllum commune）和灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）的OMPDC序列的相同性分别为58％和64％,相似性分别为74％和78％。对24种真菌的OMPDC氨基酸序列进行系统发育分析表明,系统进化树中草菇与灰盖鬼伞、裂褶菌、双色蜡蘑（Laccaria bicolor）和白腐菌（Phanerochaete sordida）聚在一起,在节点上的支持率是97％。     

龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

F3′5′H基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化

类黄酮3′5′羟基化酶(Flavonoid-3’,5-’hydroxylase;F3′5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键性酶,能使花色素的合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素。从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到了约1.7kb的F3′5′H片段。F3′5′H的cDNA序列分析结果表明,克隆得到的序列与原序列同源性达到99.34%,开放读码框为1 521 bp,编码507个氨基酸。将推算的氨基酸序列与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,发现与文献报道的存在2个氨基酸差异,氨基酸同源率为99.6%。将此基因构建到含有35S启动子的植物表达载体PBI-F3′5′H上,并通过农杆菌介导法对粉红色矮牵牛进行了遗传转化,初步鉴定获得了转基因植株。