表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建

本研究以乙型脑炎病毒SA14—14—2疫苗株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA（558 bp），用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物，回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中，获得了转移载体pPgG-PrM，并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明：与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较，PrM基因的同源性为100％。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^＋突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／PrM^＋，为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建

以乙型脑炎病毒SA14-14-2株基因组RNA为模板，采用RT—PCR一步法扩增prM／E基因的全长cDNA(约2kb)，将其克隆至pMDl8一T栽体，获得了克隆质粒pTprM／E，并对其进行了测序。序列分析结果表明，与已报道的SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸比较，prM基因的序列同源性为100％，E发生了4个点突变，其中1个为回复突变，并导致了3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒Ea株TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株为栽体，构建了1株乙脑病毒prM／E基因的重组伪狂犬病病毒TK／gG^-／ΓrM／E^ 。乙脑病毒prM／E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建，为开展乙脑病毒分子生物学及猪伪狂犬病-乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测.结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别.     

猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

乙型脑炎病毒分离株PrM／E基因澳序和SA14、SA14—14—2的序列比较

该研究通过RT—PCR扩增乙型脑炎病毒分离株PrM／E基因测序后,将测序结果与GenBanK发表的JEVSA14基因序列和SA14—14—2进行比较分析,结果发现分离株与JEVSA14强毒株的同源性为98．1％,与SA1-14-2株的同源性为97．1％;在477-2477长为2000nt决定JEV抗源性的PrM／E区中,分离株与SA14株仅有40个碱基不同,其中12个碱基为错义突变,导致E基因2个氨基酸序列（E135和E232）与SA14的E区两个氨基酸的不同;而分离株与SA14—14-2株有48个碱基不同,导致E基因12个氨基酸序列与SA14—14—2不同。由于确定JEV毒性的10个关键性基酸的位置均在E蛋白上,分离株与SA14强毒株这10个氨基酸的位置完全一致,因此序列的比较结果表明;乙脑病毒分离株为强毒株。由此可以看出基因分析对于病毒毒力的判断具有重要参考意义。     

鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性研究

将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株vp2基因克隆到载体pFastBac HTA中,构建重组转座载体pFVP2,然后将其转化DH10Bac感受态大肠杆菌,将vp2基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidVP2;通过脂质体转染将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacVP2。用Western blot和间接免疫荧光试验分析表明IBDV VP2蛋白在Sf9昆虫细胞获得正确表达,所表达的重组VP2蛋白分子量约50 Ku。以rBacVP2感染Sf9细胞裂解物免疫3周龄SPF鸡,在免疫后7 d可检测到ELISA抗体;免疫后14 d可检测到琼脂免疫扩散抗体。攻毒试验表明,初次免疫后14 d对IBDV超强毒株的攻击保护率为75%,2次免疫后14 d对其的攻击保护率为100%。     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

日本脑炎病毒NSl基因在大肠杆菌中的高效表达

提取日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的基因组RNA，用RT-PCR扩增其NS1基因cDNA，将其克隆到原核表达载体pET-30b( )中，转化大肠杆菌BL-21（DE3）,经IPTG诱导，NS1基因获得高效表达。SDS-PAGE分析显示，表达的融合蛋白表观相对分子质量约为46000，重组NS1蛋白占菌体总蛋白的30.8%。Western blotting分析表明，重组蛋白具有良好的免疫原性。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原优势区域的鉴定

流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis,JE）是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病,严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域,本研究设计了3对引物,将E蛋白分成3个大段,分别是EF1（1～291aa）、EF2（292～402aa）和EF3（403-500aa）,又将EF1分成4个相互重叠的小片段,分别是EF1-1（1～88aa）、EF1—2（68～155aa）、EF1—3（129～222aa）和EF1—4（202～291aa）,将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达,各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1～4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定,GST-EF2反应性最强,GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱,而GST-EF3反应性最弱,GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域,在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定,为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。     

日本脑炎病毒NS3基因截短表达及其在神经细胞定位研究

根据GenBank发表的日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因序列,合成用于克隆编码病毒NS3蛋白C端的基因片段(955~1857 bp)的引物。从感染JEV的细胞样品中,采用RT-PCR扩增出大小约900 bp的目的片段,插入到pET-28a(+)表达载体,诱导表达出NS3C蛋白。将该重组蛋白免疫小鼠制备NS3C抗血清,通过间接免疫荧光和Western blot验证,该抗血清能特异识别JEV感染Vero细胞中的NS3蛋白。使用该抗血清研究了JEV在神经细胞内的亚定位,发现NS3主要定位于JEV感染的神经细胞的胞浆中,并在细胞核周围分布明显。     

BHK-21细胞稳定测定猪乙型脑炎病毒半数细胞感染量效价（TCID_（50））的条件优化及应用

为建立BHK-21细胞测定乙型脑炎病毒（Japenese encephalitis virus,JEV）病毒效价的方法,对96孔细胞板中不同初始接种量BHK-21细胞在多种维持液中的生长状态进行探讨,发现当BHK-21细胞以1250～2500个/孔接种96孔板培养24 h后,更换含3%新生牛血清的DMEM后在37℃、5%CO2条件下可至少良好维持72～96 h。在此条件下并基于Reed-Muench法测定病毒效价的原理,本文建立了准确测定JEV TCID50的方法,利用该方法对JEV野毒分离株及商品疫苗进行测定,均获得稳定、准确的病毒效价。本实验为JEV的体外培养、病毒定量、疫苗评价等提供了一种准确、稳定、易判定的参考方法。     

狂犬病病毒磷蛋白在杆状病毒系统的表达及鉴定

为了建立狂犬病毒磷蛋白(phosphoprotein,P)的体外表达系统,本研究将RT-PCR扩增的狂犬病病毒ERA株P蛋白基因克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTA,构建重组质粒pFastBacHTA-P,并转染昆虫细胞Sf9包装形成重组杆状病毒。SDS-PAGE分析显示重组质粒pFastBacHTA-P转染的Sf9细胞中出现了分子量约为42 kDa的蛋白条带,Western blot证实分子量约为42 kDa的蛋白能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)分析进一步显示Sf9细胞表达的P蛋白与抗P蛋白单克隆抗体能特异性结合。这些实验证明,狂犬病病毒P蛋白不仅在Sf9细胞中获得表达,而且具有良好的免疫反应性。狂犬病病毒P蛋白杆状病毒表达体系的建立,为蛋白结构的解析和诊断试剂的研制奠定了基础。     

宿主菌株及培养温度对乙型脑炎病毒cDNA克隆稳定性的影响

本研究旨在探讨宿主菌株及培养温度对JEV cDNA克隆在宿主菌中稳定性的影响。选取猪源乙型脑炎病毒基因Ⅰ型HEN0701株和基因Ⅲ型SH0601株为研究对象，分别将两毒株基因组克隆中不稳定的质粒转化不同大肠杆菌菌株，并改变转化菌的培养温度，将不同条件下培养的质粒进行序列分析。试验结果表明，不同宿主菌株对重组质粒不稳定性的影响不显著；低温培养可以克服克隆序列的不稳定。对获得的突变质粒的分析结果显示，基因组5'端的3个起始密码子和E蛋白可能与质粒的不稳定性相关。     

小反刍兽疫病毒H基因在杆状病毒中的表达

从小反刍兽疫病毒全长cDNA中对血凝素蛋白H基因进行特异扩增,回收PCR产物分别连接于T载体酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBacHT,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒。重组质粒转染sf9细胞后连续传3～4代,分别收获细胞上清及沉淀用于SDS-PAGE及Western blot对重组H蛋白的检测,用抗His蛋白单抗在细胞中检测到H标签蛋白,单抗在细胞及上清中检测到大小为46 ku的融合蛋白。     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)奉贤株(FX2010)的结构蛋白E基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和Western blot试验检测结果表明,E基因在大肠杆菌中得到了表达,并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E基因的成功表达为DTMUV的诊断试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。     

乙型脑炎病毒基因组cDNA克隆在宿主菌中不稳定因子的初步研究

为了探求乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组cDNA克隆在宿主菌中不稳定遗传的影响因子,本研究以猪源JEV HEN0701株基因组片段1~2913 bp为研究对象,分析基因组原核启动子和相关毒力基因在不稳定遗传中的作用。在5’端,分析片段中潜在的原核启动子序列,通过PCR扩增得到不同长度的cDNA片段;在3’端,通过内切酶酶切截断基因组prM蛋白或E蛋白编码区,获得3’末端不同的cDNA片段。将各片段克隆入pCR-BluntII-TOPO载体,转化大肠杆菌,于37℃条件下培养。结果显示,片段73~2913 bp、97~2913 bp、355~2913 bp及1~933 bp、1~1275 bp能够在转化菌中稳定遗传;含有其他片段39~2913 bp、54~2913 bp及1~1800 bp、1~1971 bp的重组细菌不能在37℃条件下生长;片段1~1600 bp虽然能够在转化菌中传代,但是出现不规律突变。以上结果表明:软件所预测各原核启动子片段中,基因组73~118 bp区域与cDNA克隆稳定性有关,且上游的54 bp至73 bp的序列对该区域启动子存在影响;在JEV基因组1275 bp至1600 bp之间可能存在毒性蛋白编码序列。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因生物信息学分析及可溶性表达

为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后合成并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Opti-E2;转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经SDS-PAGE和Western blot分析,成功获得大小为43 kDa的BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好。本试验E2蛋白的成功表达可为后续ELISA方法的建立和亚单位疫苗的开发奠定基础。