水稻ISA1基因的克隆与分析

[目的]克隆水稻ISA1基因,分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[方法]以粳稻品种日本晴为试验材料,采用半定量RT-PCR技术分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[结果]水稻淀粉去分支酶1cDNA序列ORF编码811个氨基酸残基;同源性比较和系统进化树分析表明,水稻ISA1基因与其他物种已发表的ISA1基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别在66.8%～83.0%和69.0%～83.3%,且与大麦、小麦等物种亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析表明,ISA1基因在叶、根、茎中不表达,在灌浆期12d胚乳中的表达量最大。[结论]该研究结果为进一步研究ISA1基因的表达和调控机制奠定了基础。     

甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

[目的]为甘蔗的基因工程育种提供理论基础和技术储备。[方法]从甘蔗嫩叶中提取总RNA,根据GenBank中甘蔗ACC氧化酶cDNA序列设计2对引物,利用RT-PCR技术扩增甘蔗ACO cDNA序列。构建甘蔗ACO cDNA正义植物表达载体和反义植物表达载体,并利用含ACC氧化酶基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞。[结果]从甘蔗嫩叶中提取总RNA的OD260/OD280为1.90,说明提取RNA完整性好、纯度高,完全可满足cDNA逆转录的要求。所获得的甘蔗ACC氧化酶cDNA序列全长为969bp,与GenBank中甘蔗ACOcDNA的核苷酸序列同源性为98.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。成功构建了正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,并将其导入根癌农杆菌EHA105中。[结论]该研究为研究该基因的功能和培育甘蔗转基因新种质资源奠定了基础。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1 088 bp,其中ORF 771 bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80 kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOR141的克隆与表达分析

[目的]克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉受体基因AcerOR141,并对其全长序列和表达谱进行分析,为该基因的功能研究奠定基础。[方法]利用PCR扩增和基因克隆技术获得中华蜜蜂嗅觉受体基因AcerOR141的cDNA全长序列;利用多种生物信息学软件对该基因编码的氨基酸序列进行结构预测、序列比对和进化树分析;利用qRT-PCR技术检测该基因在1、5、10、15、20、25和30日龄工蜂各组织中的表达情况。[结果]AcerOR141 cDNA全长为1 659 bp,ORF序列长度为1 299 bp,编码432个氨基酸,有7个跨膜结构且N端位于胞内,无信号肽,第184～421位氨基酸之间存在一个昆虫嗅觉受体7tm-6 superfamily的保守结构域。序列比对和进化树分析表明,AcerOR141与西方蜜蜂AmelOR141的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性高达91%。荧光定量PCR结果显示,AcerOR141 mRNA在工蜂触角和头部的表达较高,且极显著高于其他组织(P0.01);在胸、腹、足和翅膀中仅有微量的表达。[结论]克隆获得AcerOR141的全长cDNA序列,其编码产物具有昆虫嗅觉受体的典型结构特征;明确了该基因在中华蜜蜂成蜂触角和头部中有较高的表达,推测其表达产物为普通嗅觉受体蛋白,可能参与挥发性气味分子的识别过程。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1088bp,其中ORF771bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达

[目的]克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础.[方法]在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列.扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达.[结果]通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa) OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB) 2330 bp序列.结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225 bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56 bp处,终止密码子(TGA)后有一段201 bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96 kDa,等电点pI=6.30.经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白.[结论]克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.     

改良Trizol法从灌浆期小麦胚乳中提取高质量总RNA的研究

[目的]在传统的Trizol法基础上进行改良,探索一种适合于灌浆期小麦胚乳高质量总RNA提取的方法.[方法]用改良的Trizol法从花后10、15、20 d的小麦胚乳中提取总RNA,经核酸分析仪及电泳检测其质量,进行RT-PCR扩增小麦SBEⅡa基因片段并测序比对.[结果]OD260/OD280:1.95～1.98,OD260/OD230:2.0～2.25,产率:544.00～645.46 μg/g,表明提取的总RNA浓度和纯度均达到要求.测序及Blast比对表明成功克隆小麦SBEⅡa基因片段.[结论]改良后的Trizol法可以高效的从灌浆期小麦胚乳中提取高质量的总RNA.     

四季鹅C4B基因的克隆及其表达(英文)

[目的]克隆四季鹅的C4B基因,并检测其在鹅体内的表达情况。[方法]应用RACEPCR的方法克隆C4B基因的cDNA序列,登录GenBank进行多物种蛋白氨基酸序列比对并构建进化树,以分析同源性。[结果]四季鹅C4B与鸡、鹌鹑2种禽类的同源性较高;在成体鹅中C4B主要在肝、肺中呈现高水平表达,在附睾、输精管、脑、肾、睾丸、心、输卵管、小肠中呈低表达。[结论]该试验应用荧光定量PCR的方法测定了C4B基因在正常状态下四季鹅不同组织、器官中mRNA的表达量,为快速诊断某些疾病提供依据。     

甘薯S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与表达

从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次获得全长1182bp的甘薯SAMS完全编码区,NCBI比对分析结果表明:该片段与不同种属植物sams基因的编码区序列的核苷酸相似性达85.48%,所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。根据核苷酸序列和氨基酸序列分别构建了SAMS系统进化树,从分子水平阐明了植物种属间的亲缘进化关系,为其种质资源利用提供理论依据。利用该序列与原核表达载体pET32a连接构建融合表达载体pET-SAMS,酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21,在不同温度下诱导3h后均表达出一63KDa大小融合蛋白。     

水曲柳结构域重新甲基化酶DRM基因片段的克隆及同源性分析

[目的]克隆并分析水曲柳结构域重新甲基化酶(DRM)基因片段。[方法]根据GenBank上已发表的DRM氨基酸序列,采取CODEHOP方法设计合成1对简并引物,采用RT-PCR技术对水曲柳DRM基因进行扩增,将PCR产物与pMD 18-T连接后转化至E.coli JM109感受态细胞,检测阳性克隆,测序并进行序列分析。[结果]克隆得到的DRM基因cDNA序列长802 bp,由267个氨基酸残基组成,命名为FmadrmA。序列比对表明FmadrmA与参考的12个物种的DRM在氨基酸水平上表现出较高的同源性,其与山葡萄、番茄、黄瓜、野草莓、大豆、苜蓿、玉米、烟草、拟南芥、毛果杨、水稻和乌拉尔图小麦的DRM同源性分别为61%、54%、51%、50%、60%、48%、43%、44%、37%、42%、42%和39%。系统进化树分析表明同源的DRM蛋白可大致聚为3类,而水曲柳与其他植物的亲缘关系较远。[结论]该试验成功获得了水曲柳FmadrmA基因片段,并对其进行了同源性分析,为进一步研究结构域重新甲基化酶基因及分析其表达特性奠定了基础。     

猪发育期NPY-Y1和GPR54受体基因的表达规律研究

[目的]研究猪发育期NPY-Y1和GPR54受体基因的发育性变化。[方法]分别选取初生、60、120、初情期、180日龄的苏姜猪母猪各3头,采集下丘脑、垂体、卵巢组织样品,提取组织RNA,采用荧光定量PCR分析NPY-Y1、GPR54受体基因的发育性变化。[结果]下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA从初生到初情期表达量逐渐下降,在初情期达到最低,初情期后呈上升趋势。在3种组织内,初情期与其他时期NPY-Y1 mRNA表达量均存在显著差异(P<0.05);GPR54 mRNA从初生到初情期表达量逐渐上升,在初情期达到最高,初情期后呈下降趋势。在3种组织内,初情期也与其他时期GPR54 mRNA表达量也均存在显著差异(P<0.05)。[结论]猪发育期NPY-Y1基因与GPR54基因表达存在负相关性。     

荞麦3个种子蛋白基因的序列和表达分析

【目的】阐明荞麦Fagopyrum中3个种子蛋白基因序列的特征及其在种子发育过程中的作用,为探讨荞麦种子发育过程分子机制提供理论依据。【方法】利用本地Perl程序、BLASTP、MEGA6、PLANTCARE等,分析了荞麦3个种子蛋白基因(13S球蛋白基因、11S球蛋白基因和谷蛋白基因)序列及其编码蛋白质的进化关系,预测启动子区域的顺式作用元件。通过荧光定量PCR技术分析3个基因在甜荞F.esculentum、苦荞F.tataricum和金荞F.cymosum种子发育过程中的表达情况。【结果】13S球蛋白基因含有4个外显子和3个内含子,蛋白序列长515 aa,与苦荞中的一个13S球蛋白(Gene Bank登录号:ABI32184.1)仅有6个氨基酸不同,推测二者为同一个基因,在苦荞灌浆中期表达量最高;11S球蛋白基因含有8个外显子和7个内含子,蛋白序列长914 aa,与欧洲慈姑中的一个11S球蛋白(Gene Bank登录号:ABB77213.1)亲缘关系最近,在苦荞灌浆中期表达量最高;谷蛋白基因含有3个外显子和2个内含子,蛋白序列长355 aa,与甜菜中的一个B5型谷蛋白(Gene Bank登录号:XP_010683769.1)亲缘关系最近,在甜荞灌浆中期表达量最高。3个基因的启动子区域均含有大量响应逆境和激素的顺式作用元件,以及在胚乳中表达所需的顺式作用元件。【结论】本研究获得了1个13S球蛋白基因序列、1个11S球蛋白基因序列和1个谷蛋白基因序列,这3个基因可能在胚乳中优势表达,并且参与到逆境胁迫和激素响应的过程中;灌浆中期是种子蛋白积累的关键时期,3个基因均在这一时期大量表达,这为后续进一步研究基因功能奠定了基础。     

转基因抗虫水稻中BT蛋白表达量的研究(英文)

对转基因抗虫水稻中Bt蛋白表达量进行研究。[方法]应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量检测转基因抗虫水稻生同生长期不同部位的Bt蛋自表达量。[结果]转基因水稻灌浆期不同组织中Bt蛋白表达绝对含量的高低顺序为:叶片>未成熟种子及颖壳>根>茎杆;在水稻不同的生长发育(分蘖期、抽穗期和灌浆期)阶段,转基因Bt水稻中Bt蛋白的含量有一些变化;一般在水稻生长后期Bt蛋白的浓度有所下降,但幅度不大,对其抗性不会造成太大影响。[结论]该试验对田间害虫的防治以及转基因水稻的育种都具有重要意义。     

甘蔗脱毒健康种苗蔗糖磷酸合成酶基因差异表达分析

[目的]探究甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因表达对产量和糖分积累影响的作用机理,为提高甘蔗产量和蔗糖含量提供理论参考.[方法]以甘蔗品种新台糖22号的脱毒健康种苗和未脱毒种苗(CK)为供试材料,分别在苗期、分蘖期、拔节期和成熟期进行混合取样,包括未成熟叶、成熟叶、幼茎和成熟茎,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测分析对不同类型SPS基因(SPSA、SPSB、SPSC、SPSD1和SPSD2)在不同生长时期不同组织中的表达情况.[结果]不同类型SPS基因在甘蔗脱毒健康种苗不同部位均有表达,SPSD1和SPSD2基因在未成熟叶和成熟叶中表达量差异明显,且与CK间也存在明显差异,SPSA、SPSB、SPSD1和SPSD2基因在脱毒健康种苗1~3茎节中的表达量高于CK.在拔节期10~23茎节中,SPSA基因在脱毒健康种苗中的表达量较CK低,SPSB基因的表达量较CK高,SPSD1和SPSD2基因的表达量与CK无明显差异.在成熟期10~37茎节中,SPSB基因在脱毒健康种苗中的表达量较CK低,SPSA、SPSD1和SPSD2基因的表达量与CK无明显差异.总体上,随茎秆节间成熟度的增加,SPSA、SPSB、SPSD1和SPSD2基因在脱毒健康种苗中的表达量与CK差异逐渐减小.[结论]不同类型SPS基因在甘蔗脱毒健康种苗不同生长时期不同组织中均差异表达,推测甘蔗脱毒处理能促进叶片和未成熟茎节中SPS基因的表达,有利于提高甘蔗产量和蔗糖含量.     

高粱胚乳淀粉体发育研究

[目的]研究高粱胚乳细胞中淀粉体的发育情况。[方法]采用光学显微镜和电子显微镜相结合的技术观察高粱胚乳细胞。[结果]发育前期,高粱胚乳中的淀粉体主要由前质体发育形成,此时主要为单粒淀粉,少部分为复粒淀粉。发育中后期胚乳细胞中1个或多个淀粉体发生中心出现,淀粉体发生中心处有许多质体,质体以先形成环状膜结构、后积累淀粉的方式形成淀粉体,此时胚乳细胞中的淀粉主要为单粒淀粉和半复粒淀粉,也有少部分为复粒淀粉。[结论]该研究为高粱胚乳淀粉体的发生和发育方式的多样性提供了理论依据。     

猕猴桃胚乳培养研究

[目的]建立猕猴桃胚乳培养体系。[方法]将猕猴桃种子消毒后取胚乳作为外植体,接种于含有NAA和6-BA不同组合的1/2MS培养基上进行培养,调查不同NAA和6-BA组合对猕猴桃不同器官形成的影响。[结果]6-BA对不定芽的形成有促进作用,其中植物生长调节剂组合NAA 0.1μmol/L+6-BA 5μmol/L对不定芽的形成最有效,而植物生长调节剂组合NAA 0.5μmol/L+6-BA1μmol/L对不定根的形成最有效。[结论]该研究为猕猴桃的胚乳培养提供了技术支持。     

冬小麦生育期降水对产量敏感性分析

[目的]研究小麦不同生育期降水对产量的敏感性。[方法]以郑州市1951~2007年的降水资料和小麦单产资料为研究对象,分析不同生育期降水量与小麦产量的关系。[结果]不同时段降水对小麦产量的敏感性不同,底墒水权重占20%,越冬期降水权重占26%,返青至开花期降水权重占32%,灌浆期降水权重占-11%;其中拔节到孕穗期间降水对小麦产量影响最大,灌浆期降水为负面影响;越冬期降水距平每提高1 mm,产量增加5.22 kg/hm2,返青至开花期降水距平每提高1 mm,增收1.545 kg/hm2。[结论]根据降水量与小麦产量的关系建立数学模型,可对小麦产量的预测提供参考。     

小麦开花及灌浆期叶片叶绿素含量与产量性状的相关分析

[目的]探讨小麦开花及灌浆期叶片叶绿素含量与产量性状的相关性。[方法]以9个不同类型的小麦品系为材料,对旗叶和倒二叶的叶绿素含量、千粒重、穗粒数、单穗重等进行测定,并进行相关分析。[结果]在相同的环境条件下,不同类型的小麦在不同时期叶绿素含量均存在较大差异;小麦旗叶和倒二叶在开花期和灌浆期叶绿素含量的变化规律大致相同,都表现为先缓慢升高,灌浆1、2期达到最高峰后慢慢下降,灌浆3期下降较快,灌浆4期表现最低。旗叶在灌浆2、3期的叶绿素含量与单穗重分别呈极显著和显著正相关;灌浆2、3、4期的叶绿素含量分别与千粒重呈极显著正相关;倒二叶在开花期和灌浆1、2、3期叶绿素含量分别与单穗重和千粒重呈显著或极显著正相关;倒二叶在灌浆3期与小区产量呈显著正相关。[结论]该研究为小麦高产育种和利用提供了科学依据。     

红麻TIR1基因克隆及其表达载体构建

[目的]分析红麻运输抑制剂响应蛋白1(TIR1)基因在不同组织和不同发育时期花药中的表达情况,并构建其超量表达载体和干扰载体,为研究该基因在雄蕊发育中的调控功能打下基础.[方法]根据红麻花药转录组数据,利用生物信息学方法,克隆TIR1基因cDNA序列,实时荧光定量PCR(qPCR)分析TIR1基因在红麻保持系722B和不育系722A根、茎、叶及不同发育时期花药中的表达情况,并构建超量表达载体和干扰载体.[结果]TIR1基因的开放阅读框(ORF)为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号KY613992).qPCR检测结果显示,与不育系722B相比,不育系722A TIR1基因在四分体期花药中呈显著下调表达(P<0.05,下同),在茎和双核期花药中呈显著上调表达,在单核期花药中极显著上调表达(P<0.01);而在根和叶中,保持系722B和不育系722A中TIR1基因表达水平差异均不显著(P>0.05).超量表达载体pBI121-GFP-TIR1和干扰载体pART27-pK-Tz-Tf构建成功.[结论]红麻TIR1基因编码一个富含亮氨酸重复的F-box蛋白.红麻不育系722A的单核期花药TIR1基因表达较保持系722B极显著上调表达,可能与花药败育有关.构建的超量表达载体和干扰载体,可用于红麻TIR1基因功能及其与雄蕊发育的关系研究.