一步法RT-PCR快速检测鸡新城疫病毒强毒株

本文参照NDV融合蛋白(F)基因序列设计引物，通过一步法RT-PCR扩增到NDV强毒株的170bp大小的特异条带。试验中未检出NDV弱毒株、IBV、AIV、IBDV的RNA，能够检出NDV尿囊液毒的最低滴度为10^-5稀释度(相当于10^3.7EID50病毒量)。对山东省不同地区于1997至2003年所分离的21个NDV强毒株检测全为阳性，而6个NDV弱毒株全为阴性。整个实验操作从病毒核酸提取到判定结果，在5h内即可完成。实验结果表明，该方法特异、敏感，适用于NDV强毒感染鸡群的快速检测。     

一步法RT-PCR快速检测鸡新城疫病毒强毒株

本文参照NDV融合蛋白(F)基因序列设计引物,通过一步法RT-PCR扩增到NDV强毒株的170bp大小的特异条带。试验中未检出NDV弱毒株、IBV、AIV、IBDV的RNA,能够检出NDV尿囊液毒的最低滴度为10-5稀释度(相当于103.7EID50病毒量)。对山东省不同地区于1997至2003年所分离的21个NDV强毒株检测全为阳性,而6个NDV弱毒株全为阴性。整个实验操作从病毒核酸提取到判定结果,在5h内即可完成。实验结果表明,该方法特异、敏感,适用于强毒感染鸡群的快速检测     

荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒方法的建立及验证

根据新城疫病毒F基因的裂解位点序列,设计合成一对引物和TaqMan探针,以本室构建并保存的鹅源新城疫病毒ZJ1株F基因阳性重组质粒作为中、强毒力新城疫病毒RNA定量检测的标准品,建立检测方法。结果表明本试验建立的标准曲线循环阈值（Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为3拷贝/μL,对禽流感病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为中、强毒力新城疫病毒检测提供了一种快速高效的定量检测方法。对28株标准分离株强弱毒力的检测与经典病毒分离方法符合率达100%,对187份临床样品的检测,二者结果符合率接近90.0%。在新城疫病毒临床样品快速检测、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

荧光RT-PCR技术快速检测新城疫病毒

利用荧光RT-PCR技术对910份样品进行NDV检测,结果应用荧光RT-PCR技术可在4小时内从910份样品中检出NDV阳性30份,用病原分离技术检测部分样品,结果完全一致。荧光RT-PCR技术具有特异性高,操作简便,快速高效的特性,而且可以大大地缩短对NDV的检测时间。     

新城疫病毒强毒株的分离与鉴定

从发病率为１００％、病死率为９７％的鸡群中分离到１株病毒。该病毒凝集鸡红细胞的作用可被新城疫标准阳性血清所抑制,证明所分离的毒株为新城疫病毒。鸡胚半数致死量、最小致死量致死鸡胚的平均时间、１日龄雏鸡脑内致死指数、６周龄雏鸡静脉致死指数、血凝解脱及血凝素热稳定性等试验表明,分离毒为新城疫病毒强毒株,其毒力比标准强毒Ｆ４８Ｅ８株还强。血凝抑制试验和中和试验表明,分离毒的血凝性与Ｆ４８Ｅ８相同,但中和特性与Ｆ４８Ｅ８有较大差异     

新城疫病毒强毒株的分离鉴定

鸡新城疫是危害我国养禽业的一种严重的烈性传染病。经过多年的综合防制 ,已经基本控制了该病的爆发 ,典型新城疫的发生已逐渐减少。但是 ,1999年 10月以来 ,一些地区相继发生一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状并致部分鸡死亡的急性传染病 ,严重影响了该地区养鸡业的发展 ,给养鸡户造成很大的经济损失。为了尽快查明病因 ,以便制定有效的防制措施来控制该病的流行 ,我们对该地区采集的病料进行了病原分离鉴定 ,并对分离毒株的生物学特性进行了测定 ,现将试验方法和结果报道如下。1　材料和方法1.1　材料SPF鸡胚 ;1日龄SPF雏鸡 (自…     

不同禽源新城疫病毒强毒株对鹅的致病性研究

分别采用鸽、鸡、鸭、鹅源新城疫病毒(NDV)强毒株和NDV国内标准强毒株F48E8进行鹅的人工感染试验,对感染鹅的临床症状、增重、抗体水平和排毒情况进行详细观察,探讨不同禽源NDV强毒株对鹅的致病性以及鹅在家禽新城疫(ND)流行中的意义。结果表明,鸽源强毒株JSP0204对鹅无致病性或致病性很弱,感染鹅未表现临床症状,增重也未受到显著影响(P0.05)。而鸡源JSC0804、鸭源JSD0812、鹅源JSG0210和F48E8株均可致鹅发病和死亡,尤以鸭源JSD0812和F48E8株致病性最强,致死率高达100%。所有感染鹅均可排毒,排毒时间因毒株不同而异。研究结果表明目前流行的NDV强毒株对鹅的致病性普遍增强,并进一步证实鹅在ND流行病学中具有重要的作用。     

新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

经对部分发表在NCBI里的新城疫病毒序列进行比对,在其F基因上找到1段相对保守序列,根据保守序列设计1对引物和1条TaqMan探针,以新城疫Ⅰ系疫苗株(Mukteswar株)作为标准品,通过系列条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了一种灵敏度高、特异性强和重复性好的荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法.该方法能检测最低初始病毒浓度为102.2 ELD50/mL,且在108.2～102.2 ELD50/mL内Ct值与病毒浓度的对数值(lgELD50/mi)呈很好的线性关系,R2达到0.997 5;该方法对禽流感、禽痘病毒和禽大肠杆菌等禽病病原核酸无交叉反应;批间和批内重复性良好;临床样品检测中荧光RT-PCR与鸡胚分毒的符合率、诊断灵敏度和诊断特异性分别为98.5％,50.0％和98.4％.因此,荧光RT-PCR检测方法的建立为新城疫病毒检测提供了一种快速有效的方法,为新城疫病毒的研究奠定了一定的基础.     

新城疫病毒山东强毒株的分离鉴定

从山东流行烈性传染病的鸡群中分离出7株具有血凝活性的病毒，该7株病毒的血凝活性均能被新城疫La Sota株标准阳性血清所抑制，但病毒不能被中和，仍能致死鸡胚。经分离鉴定，分离毒均为新成疫病毒株。通过鸡胚半致死量（ELD50）、最小致死量致鸡胚的平均时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内致死指数（ICPI）、6周龄雏鸡静脉致死指数（IVPI）、血凝解脱及血凝素稳定性等试验表明：7株分离病毒均为新城疫病毒强毒性，其毒力与标准强毒株F48E9株相似。     

基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株

为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR)。该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方法检测,验证该方法的特异性;通过对副粘病毒I型(APMV-1)和NDV中强毒株(vNDV)不同浓度病毒液进行检测,确定该方法的灵敏度,并与TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法进行比较。结果显示本研究所建立的方法对11株NDV检测的特异性为100%(11/11),优于TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法(10/11);所建立的duplex LNA rRT-PCR方法检测中强毒株F48E9和弱毒株LaSota的灵敏度分别为10个EID50和0.1个EID50,比美国农业部推荐的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法低10倍。本研究利用新型LNA探针技术,建立了鉴别NDV中强毒株与弱毒株的duplex LNA rRT-PCR检测方法,可以特异性检测NDV并有效区分中强毒株与弱毒株,适合用于鸡场和进出境动物产品中NDV的快速检测。     

RT-PCR结合限制性内切酶分析法区分NDV强弱毒株

通过设计的特异引物，采用RT-PCR对1996年以来分离的45株国内新城疫病毒分离株进行鉴定和分析，并与其MDT实验结果进行比较，建立了RT-PCR结合BglⅠ内切酶分析区分新城疫强弱毒的方法。此方法操作简便、迅速，不仅能区分新城疫的强弱毒株，还可诊断AMPV-1引起的其他禽类的感染。     

新城疫病毒通用型实时RT-PCR检测方法的建立与应用

采用TaqMan方法,经引物和探针的设计、筛选及反应条件优化,研究了检测活禽和禽产品中新城疫病毒的通用型实时RT-PCR(RRT-PCR)方法。结果显示,对12株分别为速发型、中发型、缓发型和疫苗株新城疫病毒的尿囊液倍比稀释液的检测极限在10-5~10-7之间;建立的方法与常见禽类病毒无交叉反应,特异性良好;在检测人工感染肉鸡的脏器组织、咽喉、泄殖腔拭子中病毒的灵敏度同鸡胚分离试验基本一致;弱毒疫苗免疫鸡群在免疫后14 d,应用本方法不能从咽喉、泄殖腔拭子中检测到病毒;临床样品检测表明,该方法不仅可以检出中强毒力新城疫毒株,也可检出缓发型野毒株和疫苗毒株。     

实时荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒RNA

根据新城疫病毒（NDV）核苷酸序列，设计针对中、强毒力NDVF基因编码融合蛋白裂解位点的核苷酸序列引物和TaqMan探针，建立了实时荧光定量反转录荧光定量PCR（RRT—PCR）检测中、强毒力NDVRNA的方法。该方法能从舍有NDVI系疫苗毒、NDV标准强毒株F48E9（基因Ⅸ型）、分离鸡源强毒株（基因Ⅶ型）和鸽源强毒株（基因VI型）样本中检出NDVRNA，不与NDV弱毒株（LaSota、Clone30、B1、V4）、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒及健康鸡组织RNA发生交叉反应，对NDV核酸的最小检出量为60个拷贝，具有检测速度快、特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等特点。从9个临床样本中均检测出阳性信号（9／9），PCR产物经测序证明均舍有NDV强毒株F基因裂解位点；用其中8份病料接种SPF鸡胚分离病毒，分离率为5／8。     

狂犬病病毒快速荧光RT-PCR检测方法研究与应用

采用TaqMan方法,根据古典狂犬病病毒非编码区及N基因编码区序列,设计合成多对引物和多条探针,通过对引物、探针的筛选,反应条件的选择和优化,建立了古典狂犬病病毒荧光RT-PCR检测技术。与病毒分离鉴定、常规RT-PCR试验比较表明,建立的荧光PCR检测技术快速、敏感,检测时限3 h以内。特异性试验表明本方法与犬瘟热病毒,犬细小病毒,犬Ⅰ型腺病毒不发生交叉反应。初步动物感染试验及定量检测研究及表明,本方法可用于感染动物不同组织样品中病毒的相对定量。对132份临床样品和4种商品化疫苗进行检测研究表明,本方法适用于样品中狂犬病病毒的直接检测以及疫苗中活病毒或灭活病毒的检测。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒（NDV）基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物，建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示，强毒株可以扩增出442bp的特异性片段和671bp的通用片段，弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR，整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定，该方法最低能检测到100pg的NDV RNA。     

Characterisation of genotype VII Newcastle disease virus (NDV) isolated from NDV vaccinated chickens,and the efficacy of LaSota and recombinant genotype VII vaccines against challenge with velogenic NDV

A Newcastle disease virus (NDV) isolate designated IBS002 was isolated from a commercial broiler farm in Malaysia. The virus was characterised as a virulent strain based on the multiple basic amino acid motif of the fusion (F) cleavage site ¹¹²RRRKGF¹¹⁷ and length of the C-terminus extension of the hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene. Furthermore, IBS002 was classified as a velogenic NDV with mean death time (MDT) of 51.2 h and intracerebral pathogenicity index (ICPI) of 1.76. A genetic distance analysis based on the full-length F and HN genes showed that both velogenic viruses used in this study, genotype VII NDV isolate IBS002 and genotype VIII NDV isolate AF2240-I, had high genetic variations with genotype II LaSota vaccine. In this study, the protection efficacy of the recombinant genotype VII NDV inactivated vaccine was also evaluated when added to an existing commercial vaccination program against challenge with velogenic NDV IBS002 and NDV AF2240-I in commercial broilers. The results indicated that both LaSota and recombinant genotype VII vaccines offered full protection against challenge with AF2240-I. However, the LaSota vaccine only conferred partial protection against IBS002. In addition, significantly reduced viral shedding was observed in the recombinant genotype VII-vaccinated chickens compared to LaSota-vaccinated chickens.     

鸭新城疫病毒和流感病毒多重RT-PCR鉴别诊断技术的建立和应用

对同样以引起鸭产蛋下降为主要特征的鸭流感病毒（AIV）分离株和鸭新城疫病毒（NDV）YH99V分离株，通过设计特异性引物和优化体系反应条件，建立了一种早期快速鉴别诊断鸭AIV和鸭NDV的单项RT—PCR方法和多重RT—PCR方法，AIV的扩增片段大小为483bp，NDV的扩增片段为310bp，电泳快速，易于区分。敏感性试验表明，该方法比HA敏感100倍以上；对AIV、YH99V、IBV、IBDV及正常鸡胚尿囊液的混合液检测显示，多重RT—PCR法具有很强的特异性。对鸭病毒性产蛋下降征侯群送检病料的检测证明，该方法能有效鉴别AIv和／或NDV单独感染或混合感染，阳性检出率明显高于HA方法。     

禽流感病毒和新城疫病毒二联RT-PCR检测方法的建立

参照国内外已发表的禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据禽流感病毒M蛋白基因和新城疫病毒NP基因各设计一套特异性通用引物,扩增目的带分别为600bp和340 bp。通过对相关病毒检测,建立了AIV和NDV通用型二联RT-PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可为AIV和NDV的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础。