水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达

为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进行诱导表达,确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和Western blot分析,表明终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h目的蛋白的表达量最高,分子质量约为53ku。SDS-PAGE分析表明,葡萄糖和乙醇抑制了目的蛋白的表达,而蔗糖、甘油和二甲基亚砜提高了目的蛋白的表达量,获得的目的蛋白具有良好的反应原性。     

水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及鉴定

采用PCR技术扩增MEV VP2基因,将该基因片段定向克隆原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDSPAGE和Western-blotting分析。结果表明:该基因全长1 755 bp,其目的基因序列完全正确,能编码584个氨基酸。利用载体上的His标签对其进行纯化,经SDS-PAGE鉴定该重组蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 ku;Western-blotting验证该重组蛋白具有被抗MEV血清识别的特性,具有良好的反应原性,可为MEV基因工程亚单位疫苗、免疫学诊断方法等提供参考。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及鉴定

在分析水貂肠炎病毒VP2基因主要抗原位点分布的基础上,设计了1对特异性引物,克隆一段长为846 bp,编码主要抗原位点的基因片段。将该基因片段定向插入表达载体PET-32a中,转化BL21(DE3)菌株,IPTG诱导实现高效表达。诱导表达比较实验结果表明,在37℃,IPTG浓度为1.0 mM,诱导时间为6 h,诱导表达达到最大效率。重组蛋白以包涵体形式存在,大小约为50 KD,应用兔抗水貂MEV抗体,经Western-blotting验证该重组蛋白具有MEV的抗原性,可为今后抗MEV单克隆抗体制备及相关免疫学检测方法的建立提供良好的抗原物质。     

阿留申病细小病毒的分离及VP2基因遗传衍生分析

水貂阿留申病（Aleutian disease of mink，AD）是水貂的一种慢性传染病，病原为阿留申病细小病毒（Aleutian mink disease parvovirus，AMDV），属细小病毒科、细小病毒属。AD自1940年发现以来至今60年里，已经普遍存在于世界各地人工养殖的水貂种群中。对水貂养殖业造成了不可估量的经济损失。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了对水貂肠炎病毒(MEV)疫苗免疫后抗体水平的监测和疫苗免疫效力的评价,本研究在分析MEV VP2蛋白抗原性的基础上,设计1对特异性引物克隆VP2蛋白抗原性较好的基因片段,将克隆的基因片段定向插入到pProEXHTb原核表达载体中,构建了VP2基因原核表达重组质粒pProEXHTb-VP2A,并实现在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,经鉴定表达的重组蛋白以包涵体形式存在,免疫印迹试验表明获得的重组蛋白具有与抗体较好的反应原性.应用His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白VP2A,以纯化后的重组蛋白作为ELISA诊断抗原,并对反应条件进行优化,初步建立了检测MEV抗体的VP2A-ELISA方法.确定了抗原最佳包被浓度为9.65 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:10.判定标准为S/P值≥0.312为阳性,S/P值≤0.243为阴性,介于两者之间为疑似.该抗原不与犬瘟热病毒、阿留申病毒阳性血清反应,具有良好的特异性.采用VP2A-ELISA对180份水貂血清样品进行检测,结果显示VP2A-ELISA与HI试验的符合率达到87.8%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,为现地免疫貂群抗体检测和MEV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

水貂肠炎病毒VP2基因原核表达及病毒样颗粒制备

试验旨在制备水貂肠炎病毒（Mink enteritis parvovirus,MEV）可溶性VP2蛋白及其病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）。优化并合成MEV VP2基因,克隆至原核表达载体pET-30a（+）,将重组质粒pET-30a-VP2与分子伴侣pTf16共同转化到宿主菌ER2566中,以不同培养温度、L-阿拉伯糖浓度和IPTG浓度进行诱导表达,收集样品进行SDS-PAGE和Western blotting分析。通过硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法对表达产物进行纯化,由SDS-PAGE进行鉴定,透析去除蔗糖,通过动态光散射技术（DLS）和透射电子显微镜（TEM）观察不同组装条件下VLPs的粒径和形态。用制备的MEV VLPs疫苗免疫水貂评价其免疫原性。结果显示,以2 g/L L-阿拉伯糖、0.2 mmol/L IPTG、25 ℃培养16 h为诱导条件时,VP2蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量约为65 ku。经Western blotting鉴定VP2蛋白具有良好的抗原特异性。将此表达产物利用硫酸铵沉淀结合蔗糖密度梯度离心法纯化后,纯度可达90%以上。在pH 8.0,150 mmol/L NaCl的透析液中,VP2经自组装可形成与天然MEV形状和粒径相似且具有血凝特性（1：2¹⁴）的VLPs。VLPs疫苗免疫水貂21 d后,测得水貂血清中的血凝抑制（HI）抗体水平均相对最高,可达1：2¹¹,说明该VLP疫苗有较好的免疫原性,能有效预防MEV的感染。本试验结果表明,将pET-30a-VP2与pTf16在原核表达系统中共表达,可获得具有高免疫原性的VLPs,为后期MEV VLPs疫苗的研发奠定基础。     

鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建

将鹅细小病毒VP2基因在克隆到原核表达载体pPROEX-HTb及真核转移载体pFASTBAC-HTb中，重组真核转移载体在DH10BAC中经转座作用，成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX-HTb-VP2和杆状病毒表达载体BAC-VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析，确定为阳性重组子。     

口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测

将口蹄疫病毒VP2基因连接到原核表达载体pPROEX^TM HTb上，获得重组质粒pPR-VP2。将此质粒转化感受态菌DH5α中，经终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导，1h～6h依次收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，在4h后表达量可达到高峰。经过软件分析，表达产物占总菌体蛋白的23．1％，大小为33Ku左右。根据Ni-NTA纯化系统说明操作，获得较纯的VP2融合蛋白。以牛抗O型口蹄疫病毒血清为第一抗体，通过Western blot和Dot ELISA鉴定，纯化后的VP2融合蛋白可以与牛抗O型口蹄疫病毒血清发生特异性反应。     

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析

试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础。从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体。序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80%,CPV-2b型占20%。本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低。Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性。该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

水貂细小病毒NS1与VP2蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了比较VP2和NS1两种蛋白的免疫原性,选择免疫原性较好的蛋白进行亚单位疫苗制备。本试验分别扩增了水貂细小病毒(mink enteritis virus,MEV)NS1与VP2基因,连接pET-32a表达载体并进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。以His-Bind亲和层析柱纯化目的蛋白,将纯化后的蛋白免疫小鼠,分析目的蛋白的免疫原性。经SDS-PAGE与Western blotting鉴定,表明NS1与VP2蛋白大小分别为83 和67 ku,且均具有生物学活性;免疫小鼠后,目的蛋白NS1和VP2均可诱导小鼠产生抗MEV特异性抗体,且VP2蛋白诱导小鼠产生的抗体滴度要高于NS1蛋白。与NS1蛋白比较,VP2蛋白更适合亚单位疫苗的制备。     

Prokaryotic Expression and Immunogenicity Analysis of Mink Parvovirus NS1 and VP2 Protein

In order to develop subunit vaccine of mink enteritis virus,the immunogenicity of mink parvovirus protein NS1 and VP2 had been evaluated.Two pairs of primers were designed,and the full-length NS1 and VP2 genes had been amplificated,and then prokaryotic expression vector pET-32a-NS1,PET-32a-VP2 were constructed.After the analysis of SDS-PAGE and Western blotting,target proteins had been purified by His-Bind affinity chromatography.The immunogenicity of purified protein NS1 and VP2 were evaluated by serum ELISA testing,after inoculated BALB/c mouse.The results showed that the molecular mass of NS1 and VP2 protein were 83 and 67 ku by SDS-PAGF and Western blotting;Although both target protein NS1 and VP2 had the ability to induce BALB/c mouse to produce anti-MEV specific antibodies,the level of antibodies induced by the protein VP2 was higher than protein NS1.Mink parvovirus protein VP2 was more suitable for the development of subunit vaccine.     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

检测动物产品中水貂阿留申病毒和犬细小病毒复合PCR方法的建立和应用

水貂阿留申病（AD）和犬细小病毒病（CP）是危害经济动物健康的重要疫病,可造成巨大的经济损失。本研究建立了水貂阿留申病毒（ADV）、犬细小病毒（CPV）复合PCR检测方法,并对临床样品进行了大量检测,结果表明本方法特异、敏感、简便、快速,非常适宜临床样品的大量筛选检测,对经济动物疫情的快速诊断与控制、加强经济动物及其产品进出境的检验检疫工作,御疫情于国门之外有重要的意义。     

Analysis of Clone and Prokaryotic Expression of Canine Parvovirus VP2 Gene

The study was aimed to investigate the epidemic situation of canine parvovirus in Hebei and Gansu provinces.VP2 protein was expressed by prokaryotic system and polyclonal antibodies were prepared, which provided a basis for the further researches on pathogenesis and therapy of canine parvovirus.Virus genomic DNA was extracted from 10 epidemic materials of suspected infected dogs and VP2 gene was amplified.The target fragments of VP2 gene were cloned to pET-30a vector after sequencing and analysis, then the positive expression plasmids were transformed into E.coli BL21 (DE3) cell.Polyclonal antibodies were prepared by immunizing guinea pigs with the SDS-PAGE identification of purified protein.The genetic analysis results showed that the VP2 gene was successfully cloned and 80% samples were belonged to CPV-2a and 20% samples were belonged to CPV-2b.The isolated strains of the test and part of China strains were gathered into a branch which had certain distance with strains of Korea and USA, and that had low homology with strains of Italy.SDS-PAGE results indicated that the recombinant protein with a molecular weight of 70 ku was expressed by prokaryotic system.Western blotting results showed that the recombinant protein had good immuneoreactivity and immunogenicity.The study indicated that CPV-2a was the predominant gene type in Hebei and Gansu provinces, meanwhile VP2 protein expressed by prokaryotic system had good antigenicity.This research provided a basis for the future study of the prevention and control of canine parvovirus.     

水貂阿留申病诊断技术研究进展

水貂阿留申病是水貂养殖业的重要疫病,目前无疫苗预防,主要通过发展诊断技术,淘汰感染貂防控该病。论文总结了在貂场应用的基因与抗体检测技术,基因检测具有高灵敏度和特异性,能够检测到动物带毒感染,不同类型的基因检测技术对变异性强的阿留申病毒检测各有所长;抗体检测是水貂阿留申病的主要检测方式,研究者不断创新和改进原有技术,趋向对阿留申病的规模化精准检测,但单一的抗体检测方法淘汰感染貂具有局限性。论文通过对两类检测技术分析,建议采用基因与抗体的联合检测方法,从感染貂群中区分耐受貂或抗性貂,期望为国内高感染率貂场的检测和选种提供参考。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。