转双Bt基因欧洲黑杨毒蛋白季节变化及抗虫性分析

利用美国白蛾和柳蓝叶甲对转Cry1Ac-Cry3A-BADH-MtlD基因欧洲黑杨进行抗虫性筛选,对筛选出具有双高抗虫性的5个转基因株系进行外源基因PCR检测,利用酶联免疫吸附法(ELISA)对5个转基因株系叶片Bt毒蛋白含量进行检测,分析5个转基因株系叶片中2个Bt基因在生长季节不同时期的表达情况,对其差异进行分析;检测转基因株系对不同虫龄美国白蛾和柳蓝叶甲的抗性。结果表明:(1)初步筛选出5个高抗虫性的转基因株系1号、7号、9号、11号和12号,其对美国白蛾和柳蓝叶甲1龄幼虫致死率均超过90%以上;(2)PCR检测结果表明5个转基因株系叶片中均检测Cry1Ac-Cry3A基因条带,而对照则未检测到,证明外源基因均已插入到受体杨树基因组中;(3)转基因株系均检测到Bt毒蛋白,而对照则未检测出。从6月至10月,转基因株系叶片中Cry1Ac毒蛋白的表达量总体呈上升趋势,但在6月、7月略有下降;Cry3A毒蛋白的表达量从6月至10月总体呈下降趋势;(4)美国白蛾和柳蓝叶甲随虫龄的增大致死率呈下降趋势,不同转基因株系间抗虫性存在显著差异。     

抗虫Cry2Ab基因的原核表达及玉米的遗传转化

玉米的产量深受虫害的影响,抗虫Cry2Ab基因对玉米黏虫抗性有重要意义。利用外源抗虫基因Cry2Ab构建到原核表达载体pET-22b中,对其进行SDS-PAGE检测和抗黏虫性鉴定。SDS-PAGE检测结果表明,Cry2Ab基因编码的杀虫蛋白在大肠杆菌BL21中得到正确的表达,条带大小为70.68 kD;抗黏虫性鉴定结果表明,当Cry2Ab蛋白浓度为100μg/g时,对东方黏虫致死率达到86.66%。同时构建pCAMBIA3301-Cry2Ab-Bar植物表达载体,通过农杆菌介导法将外源抗虫基因Cry2Ab转入玉米自交系GSH9901愈伤组织中,利用除草剂筛选及PCR技术检测得到T₁转基因阳性植株4株。获得的转基因抗虫玉米植株为抗虫转基因玉米的研发及抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

转双Bt基因巨霸杨外源基因表达及抗虫性检测

为提高转基因杨树中Bt基因的表达效率并扩大抗虫谱,以同时转入Cry1Ac和Cry3A基因的转双Bt基因巨霸杨(Populus deltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)株系1年生苗为材料,对外源基因的表达和抗虫性进行检测。经PCR检测,证明目的基因已被整合到巨霸杨基因组中。利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了4个转基因株系叶片中Bt基因的转录丰度和毒蛋白表达量。结果表明:不同株系间Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因的转录丰度;2种Bt毒蛋白表达量在各株系间存在显著差异,Cry3A毒蛋白质量分数均显著高于Cry1Ac毒蛋白质量分数。各株系对鳞翅目害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫抗虫效果不明显,且无显著差异;对鞘翅目害虫柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)表现出极高抗虫效果,且均显著高于转单基因Cry3A 741杨高抗株系CC84,不同株系间存在显著差异。     

转Cry抗虫基因玉米对家蚕的安全性评价

家蚕可能通过取食漂移到桑叶上的玉米花粉从而受到转基因玉米中表达的Cry蛋白的影响。实验采用室内生物测试的方法评价了转cry1Ab和cry2Ab基因玉米GAB-3花粉对家蚕可能产生的影响,并采用在饲料中掺入蛋白的方式检测了转基因玉米中广泛使用的6种Cry杀虫蛋白对家蚕的毒性。当桑叶上GAB-3花粉密度为50粒·cm^-2时,对家蚕幼虫存活率无显著影响,达500粒·cm^-2时,家蚕14 d存活率为0;以10粒·cm^-2的GAB-3花粉饲喂家蚕幼虫7 d对其体重无显著不利影响,但延长饲喂时间或者当GAB-3花粉密度为50粒·cm^-2时,家蚕的体重显著低于对照组;转基因和非转基因玉米花粉处理14 d或更长时间的家蚕体重均低于无花粉处理组。与非转基因对照处理组相比,低于100粒·cm^-2的转基因玉米GAB-3花粉处理组家蚕的化蛹率、茧重、茧壳重和蛹重无显著差异,转基因玉米和非转基因玉米花粉处理均会延长家蚕幼虫的发育历期。GAB-3花粉对家蚕7 d的LC₅₀为261.18粒·cm^-2,随着处理时间延长,LC₅₀下降。测试的6种Bt杀虫蛋白对家蚕的毒性依次为Cry1C>Cry1Fa>Cry1B>Cry2A>Cry1Ab>Cry1Ac。目前,在中国接近商业化的转基因玉米中多采用的Bt杀虫蛋白为Cry1Ab和Cry2A,二者对家蚕的毒性较低,并且在实际生产中,家蚕接触到的转基因玉米花粉密度较低,因此转Cry抗虫基因玉米对家蚕的风险较低。     

Bt玉米杀虫蛋白含量的时空表达及对亚洲玉米螟的杀虫效果

 利用ELISA方法对2个转Cry1Ab基因抗虫玉米品种MON810和Bt11在不同生育期、不同组织器官中杀虫蛋白的表达量进行了分析,利用室内生测方法研究了不同组织器官对亚洲玉米螟初孵幼虫杀虫效果,并分析了杀虫蛋白表达量与杀虫效果的相关性。结果表明,Cry1Ab杀虫蛋白在Bt玉米MON810和Bt11的不同生育期和组织中的表达量呈明显的时空动态变化,以营养生长阶段的心叶组织表达最高,分别为1880.6和1473.1ng·g-1,生殖生长阶段的花粉含量最低,分别为52.3和73.3ng·g-1。随着叶片的生长,     

玉米种子特异启动子GBSS Ⅰ的克隆及其功能分析

玉米子粒被认为是生产外源蛋白的理想载体，而利用种子（胚乳）特异性启动子是提高外源蛋白表达水平最简单的途径。从玉米基因组中克隆获得长为999 bp的GBSSⅠ基因启动子pGBSSⅠ，该序列不但含有CAAT-box等启动子基本元件，而且还包含光响应、激素调控、胁迫诱导和发育等多个顺式调控元件。利用该启动子构建植物表达载体pCBG-Gus，并经农杆菌介导法转化玉米幼胚，通过筛选和分化获得抗性植株。经Bar蛋白基因金标免疫试纸条和PCR检测确认获得转基因阳性玉米植株。对转基因玉米不同组织中Gus和内源GBSSⅠ的转录情况进行实时定量PCR分析和Gus组织化学染色分析，结果表明：2个基因的表达水平并不一致。在转录水平上，除了叶片（包括叶鞘）之外，其他被检组织中的Gus的表达均低于GBSSⅠ；在蛋白表达水平上，除了茎和根之外，其他组织中均可检测到程度不同的Gus活性表达，其中成熟种子（包括胚和胚乳）中Gus蛋白积累的水平最高。综上，玉米子粒特异启动子pGBSSⅠ是一个具有潜在应用价值的启动子，将为提升玉米胚乳中外源蛋白的表达量提供理论依据。     

转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式 PCR技术检测

本试验针对已商品化的转基因大豆、玉米和水稻的主要外源基因Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因和PAT基因及共有的内标准基因RBCL基因设计了10对引物,对从超市购买的进口大豆、玉米和水稻的11种深加工制品(未标注是否含有转基因成分)进行了五重巢式PCR定性检测。第1轮普通五重PCR检测,11个待测样品均未出现任何转基因成分,其灵敏度为0.5%;第2轮将普通五重PCR扩增产物进行五重巢式PCR检测,结果在卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品和婴儿米粉中扩增出RBCL基因,玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和PAT基因;玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和BAR基因,营养麦片扩增出内参RBCL基因和Cry1A(B)基因,在大豆精炼油、色拉油和玉米油中未检测出上述2种基因和另外3种外源基因CP4-EPSPS、BAR和PAT,其检测灵敏度为0.005%。结果提示,五重巢式PCR检测方法适用于转基因大豆、玉米和水稻深加工产品的定性检测。     

Bt杀虫蛋白在亚洲玉米螟幼虫体内组织中的分布

采用ELISA法检测了亚洲玉米螟取食转基因玉米后,Bt杀虫蛋白(Cry1Ab杀虫蛋白)在幼虫体内组织中的分布情况.结果表明,中肠和血淋巴中Bt杀虫蛋白含量最高,分别为267 ng·g-1和417 ng·g-1,丝腺、脂肪体、马氏管的含量较低,生殖器官中未检测到Bt杀虫蛋白;幼虫取食转基因玉米3d后改喂普通玉米的亚洲玉米螟发育成的蛹、成虫及卵中不含Bt杀虫蛋白.     

转基因玉米表达的猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白免疫原性鉴定

为鉴定猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(TGEV-S)在转基因玉米中的表达及对试验小鼠的免疫原性,本试验在前期TGEV-S转基因玉米植株构建成功的基础上,自玉米叶片中抽提可溶性蛋白作为包被抗原,建立筛选表达TGEV-S转基因玉米的间接ELISA检测方法。结果显示在92份被检测植株中8株为阳性,取阳性值较高的2株152-3和156-6,提取叶片可溶性蛋白,与弗氏佐剂乳化后皮下注射免疫小鼠,只有植株156-6中可溶性蛋白免疫小鼠可产生针对TGEV的抗体,而152-3免疫组检测结果为阴性。利用156-6植株叶片对小鼠进行灌胃免疫,也可产生针对TGEV的特异性抗体。以上结果表明,获得的TGEV-S转基因玉米植株不但可表达TGEV-S蛋白,而且该蛋白通过注射或口服途径免疫小鼠后均可产生针对TGEV-S的特异性抗体,提示TGEV-S转基因玉米具有发展成为TGEV口服疫苗的潜力。     

表达Cry1Ab和Cry2Ab蛋白的转基因玉米GAB-3对四种主要鳞翅目害虫的抗性评价

为评价表达Cry1Ab和Cry2Ab蛋白的转基因玉米GAB-3对黏虫Mythimna separata（Walker）、亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）、棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）和草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）的杀虫效果,采用室内生测的方法研究了GAB-3不同组织器官对以上四种害虫存活率的影响,并通过田间接虫试验进一步测试了GAB-3对黏虫和亚洲玉米螟的抗性。室内生测结果显示：转基因玉米GAB-3心叶期叶片对黏虫、亚洲玉米螟、棉铃虫和草地贪夜蛾具有很强的毒杀作用,苞叶、穗尖、穗轴、花丝、雄穗和籽粒对亚洲玉米螟和棉铃虫具有显著的抗性。田间接虫试验结果显示：心叶期GAB-3高抗黏虫和亚洲玉米螟,穗期GAB-3高抗亚洲玉米螟。上述结果表明,转基因玉米GAB-3对4种主要玉米鳞翅目害虫有很好的杀虫效果,具有较好的商业化应用前景。     

表达Cry1Ab和Cry2Ab蛋白的转基因玉米GAB-3对四种主要鳞翅目害虫的抗性评价

为评价表达Cry1Ab和Cry2Ab蛋白的转基因玉米GAB-3对黏虫Mythimna separata（Walker）、亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）、棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）和草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）的杀虫效果，采用室内生测的方法研究了GAB-3不同组织器官对以上四种害虫存活率的影响，并通过田间接虫试验进一步测试了GAB-3对黏虫和亚洲玉米螟的抗性。室内生测结果显示：转基因玉米GAB-3心叶期叶片对黏虫、亚洲玉米螟、棉铃虫和草地贪夜蛾具有很强的毒杀作用，苞叶、穗尖、穗轴、花丝、雄穗和籽粒对亚洲玉米螟和棉铃虫具有显著的抗性。田间接虫试验结果显示：心叶期GAB-3高抗黏虫和亚洲玉米螟，穗期GAB-3高抗亚洲玉米螟。上述结果表明，转基因玉米GAB-3对4种主要玉米鳞翅目害虫有很好的杀虫效果，具有较好的商业化应用前景。     

转Bt基因玉米残体Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态

采用ELISA定量法研究了(28±1)℃下转Bt基因玉米植株残体不同组织所含Cry1Ab蛋白在黄褐土和红壤中的残留动态,并对其进行方程拟合。结果表明,转Bt基因玉米植株残体不同组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留动态基本一致,均呈前期快速降低和后期稳定下降2个阶段,但同一组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留变化速率存在显著差异,黄褐土中下降明显快于红壤,1周内表现尤为显著;不同组织释放的Cry1Ab蛋白在同一土壤中其残留差异显著,且受培养时间等因素的影响,总体表现为根>叶>茎,与初始时Cry1Ab蛋白土壤可提取量表现基本一致;双指数模型比移动对数模型和指数模型更符合转Bt基因玉米残体中Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态。     

多胺对渗透胁迫下玉米幼苗叶片生理生化指标的影响

[目的]探讨多胺增强植物抗旱性的机理,为多胺作为外源生长调节物质在玉米抗旱过程中的应用提供理论基础。[方法]以聚乙二醇（PEG-6000）模拟自然干旱,用外源Spd处理抗旱性不同的2个玉米品种农大108和掖单13,检测渗透胁迫下2个品种幼苗叶片中相对含水量及可溶性蛋白含量的变化。[结果]渗透胁迫7 d,抗旱性弱的掖单13玉米幼苗叶片的相对含水量和可溶性蛋白含量的下降幅度明显大于抗旱性较强的品种农大108;外源Spd处理明显抑制在胁迫条件下掖单13幼苗叶片相对含水量的下降,并且提高了其在胁迫条件下可溶性蛋白的含量。[结论]外源Spd处理,通过提高渗透胁迫下玉米幼苗叶片内蛋白质的含量,提高了玉米幼苗的抗渗透胁迫能力。     

影响Bt稻离体叶中Cry1Ab杀虫蛋白降解的环境因子研究

 【目的】研究转Bt基因水稻表达的外源Bt杀虫蛋白在土壤中的环境去向，以便进行转BT基因水稻的生态风险性评价。【方法】室内采用ELISA法，研究了转Bt基因水稻克螟稻2号（KMD2）粉碎叶片中Cry1Ab杀虫蛋白在3种水稻土，即青紫泥田、黄筋泥田和黄松田土中不同土壤含水量、土壤pH值和温度条件下的降解动态。【结果】供试叶片粉中Cry1Ab蛋白在3种水稻土中的降解动态均可用一级化学反应动力学指数方程来拟合，降解半消减期t0.5为1.8～4.0 d。【结论】土壤含水量、pH和温度对Cry1Ab蛋白降解速率均有一定影响，但pH和温度的影响更为明显。通常pH较低的酸性土壤和低温不利于土壤中Cry1Ab蛋白的降解,特别是在酸性黄松田中降解最慢。     

2个转基因抗虫杂交棉Bt蛋白含量的时空表达特性研究

采用双抗夹心酶联免疫(enzyme linked immuno-sorbent assay,ELISA)的方法,分析了2个转苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)基因杂交棉(浙大13-1和浙大13-2)以及转Bt基因纯系亲本不同生育期和不同器官的Bt蛋白表达规律。结果表明,Bt基因在所检测的转基因抗虫杂交棉品种和转基因纯系亲本各器官中均有表达,但不同器官Bt蛋白含量明显不同,品种之间各器官的Bt蛋白含量也有明显差异。2个转基因抗虫杂交棉品种苗期以三叶期的子叶最高,苗期叶片次之;苗期根系和茎秆中Bt蛋白表达呈抛物线形,分别在第33天和第40天达到峰值,其中根系表达量高于茎秆。叶片中的Bt蛋白含量随着棉花生长发育进程而降低,盛花期Bt蛋白含量最低,之后又有所增强,整个生育期呈"V"字形规律。转基因抗虫杂交棉品种盛花期棉株各器官中,花药的Bt蛋白含量显著高于同期其他器官。2个杂交棉品种之间各器官的Bt蛋白含量的趋势基本相同,但浙大13-1器官中的Bt蛋白含量大多高于浙大13-2。亲本各器官中的Bt蛋白含量高于其杂交棉品种,但植株生长后期的叶片和花药中的Bt蛋白低于其杂交棉品种,二者有明显差异。     

piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展

 综述了基于piggyBac转座子的转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的3个关键环节：（1）外源目的基因高效插入家蚕基因组;（2）转基因家蚕的高效、快捷的检测;（3）具有生物活性的外源目的蛋白的高效表达和纯化。同时介绍了有关转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的研究进展,为更好地利用转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白提供了参考。     

转cry1Ab/cry2Aj基因玉米双抗12-5对意大利蜜蜂成虫的影响

转cry1Ab/cry2Aj基因玉米双抗12-5是我国自主研发的抗虫耐除草剂玉米品系,目前已获批准进入生产性试验阶段。蜜蜂是具有重要生态和经济意义的昆虫,是转基因植物环境安全评价中主要的非靶标节肢动物。在转基因抗虫植物种植过程中,蜜蜂可能通过采集花粉暴露于转基因抗虫植物表达的杀虫蛋白。本实验采用室内生测的方法评价了转基因玉米双抗12-5花粉和Cry1Ab杀虫蛋白对意大利蜜蜂(Apis mellifera)的影响。结果显示,喂食转基因玉米花粉处理组的意大利蜜蜂体内能检测到Cry1Ab杀虫蛋白;与对照相比,饲喂转基因玉米花粉和8 μg·mL^-1纯化的Cry1Ab杀虫蛋白对意大利蜜蜂的存活率没有显著影响,吡虫啉处理组意大利蜜蜂存活率显著低于花粉和蔗糖处理组。以上结果表明,转基因玉米双抗12-5或Cry1Ab杀虫蛋白对意大利蜜蜂的风险较小。     

吐温-20对Bt抗虫棉外源蛋白提取效率的影响

【目的】探究吐温-20对转基因棉中Bt蛋白提取效率的影响程度,为转基因植物外源蛋白提取方法标准化,进而精准转Bt基因棉品种审定准入项目检测数据提供理论依据。【方法】配制7种不同吐温-20含量的提取液,提取抗虫棉GK19及非转基因棉泗棉3号苗期叶片、蕾期叶片和小蕾、铃期叶片和小铃中可溶性总蛋白,测定提取液中Bt蛋白和可溶性总蛋白含量,比较不同吐温-20含量提取液蛋白提取效率的差异。【结果】结果表明,吐温-20对抗虫棉中外源Bt蛋白提取效率有显著影响,蛋白提取缓冲液中吐温-20含量为0.55%是最适的。【结论】在蛋白提取缓冲液中加入适量吐温-20可明显提高抗虫棉外源Bt蛋白的提取效率,而不影响标准曲线R平方值(R~2)。过量添加吐温-20,超过一定的限度,检测变异系数加大,检测值可信度降低,检测结果无意义,因此准确控制蛋白提取缓冲液成分含量十分必要。     

转Bt基因玉米幼苗残体中Ory1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。     

转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50 d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30 d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50 d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50 d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。