RNAi抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是世界上主要的猪传染性疾病之一,以妊娠母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔猪高死亡率和育成猪呼吸困难,类流感症状、发育迟缓为主要的特征。该病给各个国家的养猪业带来巨大的经济损失,目前,疫苗和抗病毒药物只能提供有限的保护。自2006年以来,不断有研究者应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术开展抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究,并取得了一些阶段性成果。对已有的研究成果进行了综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传变异研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种传染病,该病主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病,导致高死亡率,生长发育受阻,给世界养猪业造成了巨大的经济损失.PRRSV基因组存在高度变异性,美洲型和欧洲型的核苷酸序列差异较大,不同的ORF序列同源性存在不同程度的差异.论文就PRRSV基因组的遗传变异进行分析,对研究PRRS的致病机制、免疫机理及制定相应的防控措施有一定的指导意义.     

猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的研究

将广西本地分离并筛选的猪繁殖与呼吸综合征病毒株通过细胞增殖，收获感染细胞培养物，经甲醛灭活疫苗，以矿物油为佐剂制成油乳剂灭活疫苗。疫苗物理性状稳定良好，接种猪无不良反应，疫苗免疫原性良好。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征的病原体,本文对PRRSV的分子生物学研究进展进行了综述,主要包括PRRSV的基因组结构、病毒蛋白及其功能、抗原变异等,旨在为诊断技术、免疫机理研究、疫苗设计与疫病防制提供借鉴.     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是一种引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状及高死亡率的传染病。已几乎遍极世界所有养猪国家,在中国的流行和分布也日益广泛,危害日益严重。此病的传播给世界养猪业造成严重经济损失,受到国内外学者的高度重视,对此病的研究也正在逐渐深入,特别是免疫学及其疫苗的研究正日益受到关注。文章就猪繁殖与呼吸综合征病毒的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗的研究进展和使用现状做了系统地阐述,特别是通过合理地选择和使用免疫佐剂,如γ干扰素、霍乱毒素及可溶性β葡聚糖等来改进疫苗作用方面进行了阐述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行病学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又称为"猪蓝耳病",是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染而引起的一种病毒性传染病,以仔猪的呼吸道疾病和母猪生殖障碍为主要特征。该病发生以来,给世界各地区养猪业造成了不可估量的经济损失,蓝耳病已经成为集约化养猪的主要疫病之一。就目前PRRSV基因的多样性及我国现阶段主要流行的PRRSV基因变异情况作一个概述。     

金银花提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒研究

通过观察金银花提取物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的Marc-145细胞的保护效果、对病毒感染滴度(TCID50)的影响及对ORF7mRNA表达的影响来评价其体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性。结果表明,金银花提取物大孔树脂600mL/L的乙醇/水洗脱部位对PRRSV感染细胞具有较好的保护效果,最小保护浓度为6.25μg/mL。6.25μg/mL 600mL/L的乙醇/水洗脱部位使PRRSV病毒滴度从105.8 TCID50降低至100.3 TCID50左右,使PRRSV ORF7mRNA含量降低1 000多倍。因此,金银花提取物大孔树脂600mL/L的乙醇/水洗脱部位具有良好的体外抗PRRSV活性。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒双重液相基因芯片检测方法的建立

为了实现快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)并同步鉴别高致病性PRRSV毒株(HPPRRSV),根据PRRSV囊膜蛋白GP2基因保守序列和HP-PRRSV特有的Nsp2基因区保守序列设计特异扩增引物和杂交探针,通过双重一步法RT-PCR不对称扩增和双重微球杂交反应,建立了双重液相基因芯片方法。对12株PRRSV以及其他12种猪病原体的检测显示,该法能特异性检测12株PRRSV毒株并准确鉴别其中7株HP-PRRSV,与其他病原体无交叉反应;对PRRSV、HP-PRRSV病毒液的检测低限均小于每个反应0.5TCID_(50);其组内、组间检测变异系数均10%;检测55份疑似临床样品并与商品化荧光RTPCR试剂盒比较检测结果,符合率达98.2%(54/55)。研究结果为适应临床快速检测PRRSV提供了一种新的分子生物学检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究概况

猪繁殖与呼吸综合征是一种引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状的急性热性接触性传染病。该病是威胁养猪业的主要传染病之一,给养猪业带来极大危害。目前对该病缺乏有效的治疗手段,疫苗免疫接种是主要的防控措施。尽管市场上的灭活疫苗和弱毒活苗具有一定的保护作用,但都存在一定局限性。基因工程疫苗具有生产工艺简单,安全高效等优点,但仍处于实验室研究阶段。论文对猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展进行综述,以供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选

本试验旨在初步筛选出与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染相关的猪microRNA(miRNA)。采用生物信息学方法预测可能与PRRSV 3′非编码区(3′utr)产生相互作用的猪miRNA,构建PRRSV 3′utr的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK-utr,同时合成预测到的miRNA(ssc-miR-323、ssc-miR-105-1)及其相应的抑制物,共转染猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC),检测双荧光素酶活性。结果发现,ssc-miR-323与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率略有升高,ssc-miR-105-1与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率降低。初步判定ssc-miR-323对PRRSV 3′utr没有抑制作用,而ssc-miR-105-1对PRRSV3′utr有一定的抑制作用。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建

从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的诊断及其分子特点

采用流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、病毒分离、分离毒株测序以及遗传演化分析的方法,对北京及其周边地区4个猪场剖检的4头猪进行分析。结果:流行病学和临床症状表现为急性高热性传染病;病理学观察为非化脓性脑炎和间质性肺炎等多器官严重的病理变化;RT-PCR和病毒分离确定该疫情的主要病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。与典型PRRSV感染不同的是:成年猪感染率达50%以上,病死率达80%以上;PRRSV分离株全基因序列分析表明属于PRRSV北美洲型,特别是PRRSV NSP2不连续缺失30个氨基酸,说明此次流行的PRRSV毒株可能为高致病性毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞微载体上培养条件的研究

通过研究搅拌程序,细胞接种密度,微载体浓度与细胞生长的关系,探索Marc-145细胞在微载体上的生长条件,并测定猪繁殖与呼吸综合征病毒在微载体培养的细胞上的TCID50。结果表明:细胞接种密度为4.28×105 cells/mL时,病毒滴度可达到107.5TCID50,这说明利用微载体繁殖PRRSV是可行的,为猪繁殖与呼吸综合征疫苗的大规模生产奠定实验基础。     

湖南高致病性猪蓝耳病隐性感染情况调查

用ELISA和RT-PCR的方法对采集自湖南省内20个规模场1007份血清和3个市级定点屠宰场50份猪肺门淋巴结进行蓝耳病血清抗体检测和高致病性猪蓝耳病病毒的检测。结果1007份血清中,蓝耳病抗体阳性率为72.9%(734/1007),高致病性猪蓝耳病病毒携毒率为3.2%(32/1007),50份肺门淋巴结病毒阳性率为16%(8/50),其中,蓝耳病免疫与非免疫猪血清其抗体阳性率相差不显著,种猪的抗体阳性率明显高于商品猪,而其病毒携毒率为0%。部分规模猪场和眼观健康的育肥猪存在高致病性猪蓝耳病病毒的隐性感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北美型毒株和欧洲型毒株N蛋白基因保守序列,设计1对特异性引物和1条探针,以ABI公司PRRSV RNA为标准品,优化了PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测方法,25μL反应体系引物prrsv-f/prrsv-r（20μmol/L）各0.5μL,探针prrsv-p（10μmol/L）0.5μL为反应最佳工作浓度,标准曲线Ct值和模板启始浓度的log值之间具有良好的线性相关性。特异性、敏感性和重复性检测结果显示,该方法能特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株,与其他主要猪病病原检测无交叉反应;针对PRRSV RNA标准品检测,灵敏度可以达到10拷贝;重复性检测Ct值变异系数为0.74%～1.52%。用建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法,对40份临床样品检测,与商品化试剂盒检测结果完全一致。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GXA株分离及主要结构基因的克隆和序列分析

近来,广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊、仔猪呼吸道症状等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所致。本研究从病猪中采集材料,经RT-PCR检测为阳性后,接种于Marc-145细胞,经过6代盲传,发现典型的细胞病理变化(CPE),经鉴定为PRRSV,命名为GXA株,其毒价为105.33TCID50/mL。参考VR-2332和CH-1a株基因序列,设计了3对特异性引物,分别对GXA株的E、M、N基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。应用DNAstar生物学软件拼接得到GXA株的E、M和N3个基因片段共长为1473bp。同源性分析表明,GXA株与VR-2332、MLV和BJ-4的同源性为99.7%～100%,而与欧洲型代表株LV的同源性只有66.4%。表明GXA与VR-2332、MLV及BJ-4株亲缘关系比较密切,与欧洲型代表株LV亲缘关系最远,属于美洲型毒株,有可能来源于疫苗株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从广东地区发病猪场的病料中,分离到1株致Marc-145细胞病变的病毒ShB6。扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白基因ORF2-ORF7并进行序列分析,结果表明,该分离株与国内PRRSV分离株HB-1(sh)/2002的同源性为96.9%;与ATCC VR-2332株的同源性为91%;而与Lelystad株的同源性仅为59.8%;用美洲型PRRSV单抗进行免疫组化染色,结果显示在细胞病变处呈现明显的阳性着色(为棕黄色)。综合可见,所分离的病毒为美洲型PRRSV。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

Pathogenicity of emerging Japanese type 1 porcine reproductive and respiratory syndrome virus in experimentally infected pigs

To clarify the pathogenicity of Japanese type 1 porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolate in experimentally infected pigs, we evaluated clinical signs and monitored viremia for 21 days post-inoculation (dpi). Lungs were mottled, tanned and reddish in appearance; had lesions predominantly in the cranial, middle and accessory lobes; and failed to collapse at 10 dpi. Although microscopic lesions of lungs were reproduced using the Japanese emerging type 1 PRRSV isolate under experimental conditions, no significant differences were noted between the challenge and control groups regarding mean rectal temperature and daily weight gain. These results provide useful insights into the limited pathogenicity of single infection with the Japanese type 1 PRRSV isolate in piglets, which differ from findings in reported field cases.