新型反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别猪瘟强毒和弱毒疫苗方法的建立

对GenBank中登录的25株猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株基因组全序列进行比较分析,在其高度保守区设计1对通用引物,扩增片段为609bp,并在该对引物扩增区域内设计针对疫苗弱毒的特异引物,扩增片段为237bp,建立一种能够区分猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的敏感、特异、重复性好的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)鉴别诊断方法。该方法能将我国大陆地区流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒与疫苗弱毒完全区分开来,且不与牛病毒性腹泻病毒及其他猪源病毒发生非特异反应。应用本试验建立的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)方法可以及早对猪瘟作出准确诊断,并可将强毒感染猪迅速从弱毒疫苗免疫猪群中筛选出来,减少了未感染免疫猪被误杀的可能性。     

鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种对猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）临床样本快速、简便的检测技术,以区分猪瘟（classical swine fever,CSF）野毒和疫苗毒感染,为规模化猪场CSF净化奠定基础。通过对GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因组全序列比对,发现CSF兔化弱毒疫苗株3’-NTR独立存在富含T的插入序列,根据这一特点分别在该插入序列的上、下两端设计2对单一RT-PCR引物并选择特异保守区域设计了二重RT-PCR引物,优化筛选能够鉴别CSF野毒与兔化弱毒疫苗的PCR反应条件,建立了能鉴别CSF野毒和疫苗毒的单一与二重RT-PCR鉴别诊断方法。敏感性和特异性分析表明,单一RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为2.2 pg（单一RT-PCR中的1对引物）和1.7 pg（单一RT-PCR中的另外1对引物）;二重RT-PCR检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为8.2 pg（CSF野毒）和6.7 pg（CSF疫苗毒）,两种方法均检测不到PRV、PRRSV、JEV、BVDV、PCV2的DNA/RNA。采用该方法对146份可疑临床样品进行检测,结果表明CSF疫苗毒与野毒在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的二重感染率分别为6.3%、7.4%、8.3%、8.6%。本研究建立的单一与二重RT-PCR方法都具有敏感性强、特异性优、重复性好的特点,该研究对规模化猪场猪瘟的净化具有十分重要的参考价值。     

哺乳仔猪免疫蓝耳病弱毒疫苗对猪瘟免疫抗体水平的影响

为探索哺乳仔猪免疫蓝耳病弱毒疫苗对猪瘟免疫抗体水平的影响,本试验通过对哺乳仔猪14日龄免疫猪蓝耳病弱毒疫苗,21日龄免疫猪瘟弱毒疫苗,50日龄（猪瘟免疫后30d）检测猪瘟抗体水平。结果：经典猪蓝耳病弱毒疫苗（CH-1R株）和高致病性猪蓝耳病疫苗（JXAl-R株）对猪瘟免疫抗体的产生均有抑制作用（分别为P〈0．05、P〈0．01）,且高致病性蓝耳病弱毒疫苗（JXA1-R株）对猪瘟免疫抗体产生的抑制作用显著高于经典蓝耳病弱毒疫苗（CH-1R株）。     

猪瘟诊断技术的应用进展

猪瘟是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性传染病,被世界动物卫生组织（OIE）列为A类动物疫病。近年来,我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化,影响了养猪业的发展。牛病毒性腹泻病病毒（BVDV）与猪瘟病毒（CSFV）同属于瘟病毒槿,且与CSFV存在血清学交叉反应,对猪瘟的诊断造成了干扰。此外,猪瘟免化弱毒疫苗（HCLV）的大规模应用,也给CSFV野毒感染猪和疫苗感染猪的鉴别诊断带来较大困难。     

关于猪瘟兔化弱毒疫苗的探讨

猪瘟作为一种严重危害养猪业的毁灭性传染病,为畜牧业的发展造成了一定的阻碍,猪瘟病毒兔化弱毒株具有优良的免疫原性,在我国使用比较广泛.文章探讨了猪瘟兔化弱毒疫苗的生物学特性,包括其遗传特性、对猪的免疫原性、对猪的安全性,猪瘟兔化弱毒疫苗的应用.     

猪瘟诊断技术的应用进展

猪瘟是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性传染病,被世界动物卫生组织（OIE）列为A类动物疫病。近年来,我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化,影响了养猪业的发展。牛病毒性腹泻病病毒（BVDV）与猪瘟病毒（CSFV）同属于瘟病毒槿,且与CSFV存在血清学交叉反应,对猪瘟的诊断造成了干扰。此外,猪瘟免化弱毒疫苗（HCLV）的大规模应用,也给CSFV野毒感染猪和疫苗感染猪的鉴别诊断带来较大困难。     

3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫苗免疫效力的影响

将 2 0头 9月龄左右猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合征抗原、抗体阴性猪分成 6组 ,分别利用猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV)单独或混合感染。 7d后连同对照猪 4头 ,免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗 (HCL V) ,13d后连同 4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门强毒。整个试验期间分别每天测温 ,观察临床症状 ,每周采集扁桃体和血样做各种病毒抗原及抗体检测。结果表明 ,非猪瘟病毒感染 7d后 ,所有各组猪均从体内检测到了相应感染的病原 ,表明 3种非猪瘟病毒感染成功。在攻击猪瘟石门强毒后 2周 ,感染了非猪瘟病毒后接种 HCL V疫苗的 4个免疫组 12头猪除 1头外 ,11头全为猪瘟病毒 (HCV)抗原检测阳性 ,且多呈强阳性 ;而单一 HCL V疫苗免疫组在猪瘟强毒攻击后检测不到 HCV;所有 HCL V疫苗免疫猪均存活 ,而非免疫对照组 4头猪全部在攻毒 16 d内死亡。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

蟾酥注射液对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果影响的试验观察

为观察蟾酥注射液对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果的调节作用,选择高、中、低剂量(0.2mL/kg、0.1mL/kg、0.05mL/kg)的蟾酥注射液与猪瘟兔化弱毒疫苗联合使用作试验组,猪瘟兔化弱毒疫苗组、猪瘟兔化弱毒疫苗与盐酸左旋咪唑+黄芪多糖组、空白组作为对照。试验猪在用药前及首次用药后的7d、14d、21d、28d,通过静脉采集血液,用试剂盒检测血清中猪瘟免疫抗体效价和IL-2水平。结果显示,蟾酥注射液高、中剂量组能够显著提高接种猪瘟兔化弱毒疫苗猪的血清中抗体水平(p0.05);不同剂量蟾酥注射液对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫猪血清IL-2的产生具有不同程度的促进作用,其中蟾酥注射液高剂量组作用快,持续时间较长。本试验的结果说明蟾酥注射液是猪瘟兔化弱毒疫苗有效的免疫佐剂。综合考虑,推荐蟾酥注射液的临床应用剂量为肌内注射0.1mL/kg体重,1日2次,连用3日。     

猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞旋转培养制造猪瘟冻干苗的研究

为了克服猪瘟兔化弱毒乳免疫苗成本高,易污染的缺点,弥补采用常规猪肾细胞制造猪瘟弱毒疫苗的潜在致病危险性。本文成功的在犊牛睾丸细胞上连续增殖猪瘟化弱毒,特别是利用次代或二代细胞进行转瓶堵养,收获的猪瘟兔化弱毒其毒价稳定,细胞不易老化脱壁。现已制成猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞培养冻干疫苗,生产工艺简单,成本较低。疫苗对猪的免疫原性良好,免疫期一年以上。性能稳定,在-15℃可保存13个月,4℃保存半年以上,25℃也可保存14天。经7691头猪的免疫接种试验,证明本苗安全,无一死亡,个别猪有反应,其反应率仅为0.74%。     

鉴别猪伪狂犬病毒强毒检测方法的研究进展

为有效配合猪伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失疫苗的大规模免疫应用,准确区分强毒感染猪和疫苗接种猪,及时淘汰强毒感染猪,防止免疫猪被误杀,急需加强猪伪狂犬病强毒鉴别诊断方法的研究与推广应用。本文就近年来针对PRV强毒的PCR、荧光定量PCR、LAMP、核酸探针、ELISA、胶体金免疫技术等分子生物学与血清学诊断方法的研究与应用现状及发展前景进行综述,以期为我国猪伪狂犬病的综合防控及净化提供合理的科学依据。     

分子生物学技术在猪瘟野毒与兔化弱毒鉴别诊断方法中的研究进展

综述了分子生物学技术在猪瘟野毒与兔化弱毒鉴别诊断的4种方法(RT-PCR方法、荧光定量RT-PCR方法、RT-PCR与RFLP相结合方法、环介导等温扩增方法)的研究进展,对猪瘟的净化和防控有一定的参考价值。     

猪瘟组织灭活疫苗与猪瘟弱毒冻干活疫苗免疫效力的比较

对猪瘟组织灭活疫苗的制备方法进行了研究，并就其免疫效力与猪瘟弱毒冻干活疫苗进行了比较。结果表明，接种猪瘟组织灭活疫苗的猪群所产生的抗体水平比接种猪瘟弱毒冻干活疫苗的猪群抗体水平高1～2个稀释度，而且高效价的抗体持续期较长。     

猪瘟野毒感染抗体阻断ELISA检测方法的建立与初步评价

以猪瘟野毒E2蛋白为包被抗原、辣根过氧化物酶标记的猪瘟野毒单抗作为酶标抗体,建立检测猪瘟野毒抗体的阻断ELISA方法。猪瘟野毒E2最适包被浓度为0.03μg/mL,待检血清最适稀释度为1∶4,酶标猪瘟野毒单抗稀释度为1∶1 000。用建立的阻断ELISA方法检测369份临床阴性血清,计算阻断率,确定临界值,阻断率>40%为猪瘟野毒抗体阳性,阻断率≤40%为猪瘟野毒抗体阴性。用建立的ELISA方法检测84份血清,其中78份为免疫猪瘟疫苗的血清,6份为猪瘟病毒感染血清。结果显示,78份免疫血清均检测为猪瘟野毒抗体阴性,6份猪瘟感染血清均检测为猪瘟野毒抗体阳性。因此可初步判定该方法可用于鉴别诊断猪瘟病毒自然感染动物和C株疫苗免疫动物的血清抗体,并为临床检测猪瘟野毒抗体提供便捷、快速,精准的检测工具,对猪瘟的临床诊断、预防以及猪瘟净化工作具有非常重要的参考意义。     

一种检测猪伪狂犬病野毒方法的建立

猪伪狂犬病是危害养猪业的重要病毒性传染病,如何鉴别疫苗接种动物和野毒感染动物是控制和净化该病的前提。本试验根据不同猪伪狂犬疫苗株gE基因缺失的特点,建立了一种猪伪狂犬病野毒病原核酸的PCR检测方法。该方法可以检出猪伪狂犬病野毒,而不能检出猪伪狂犬病疫苗株,实现了疫苗毒和野毒的鉴别检验,同时不能检测出猪常见病毒性传染病病原。最低检测限度为10~3个病毒核酸拷贝。在组织样品检测中不受宿主组织核酸干扰,能区分野毒感染动物组织和疫苗免疫动物组织,是一种值得推广的伪狂犬病毒野毒检测方法。     

基于SYBR Ⅰ实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立

本研究参考GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)野毒株和弱毒疫苗株(CV777弱毒疫苗株)在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异,设计一对特异性荧光定量引物,分别建立基于SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。结合熔解曲线分析可见,其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(81.84±0.17)℃和(83.16±0.14)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现1个单特异峰,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号。结合熔解曲线可直接鉴别猪群中PEDV的感染情况和程度,可对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断,尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。     

蓝耳病疫苗对猪瘟弱毒疫苗免疫效果的影响

为了探明猪蓝耳病阳性场猪蓝病TJM-F92株弱毒疫苗是否对猪瘟疫苗免疫效果存在影响,按照不同的免疫模式将试验动物分为7组,在注射疫苗前(第0周)、注射疫苗后(第2,4,6周)采集血样,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组试验猪猪瘟、蓝耳病抗体水平,用流式细胞术检测各组猪的淋巴细胞亚群水平,从体液免疫和细胞免疫两个方面分别验证猪蓝耳病阳性场猪蓝耳病TJM-F92株弱毒疫苗对猪瘟疫苗的免疫效果是否有干扰作用。结果表明:猪蓝耳病阳性猪场蓝耳病弱毒疫苗对猪瘟疫苗体液免疫和细胞免疫应答干扰作用不明显(P0.05),说明在蓝耳病阳性猪场猪蓝耳病TJM-F92株弱毒疫苗可以和猪瘟疫苗同时免疫。     

猪瘟兔化弱毒疫苗与我国近年猪瘟野毒的免疫保护相关性试验

２批猪瘟兔化毒睾丸细胞苗分别来自两家兽医生物药品厂，各分别免疫接种猪只，随后以５株猪瘟病毒野毒分别攻击，疫苗接种猪完全存活，对照猪完全死亡。此５株野毒分离自国内不同地区，并皆已经过细致的鉴定，以免疫荧光技术对猪扁桃体进行了活体检查，各对照猪材料上能在攻击后一周时出现病毒，而疫苗接种猪在整个观察期间未出现病毒，据此，显然可见猪瘟兔化毒细胞苗在预防国内猪瘟上极有效力     

猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立敏感、特异的评价猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗中病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法,参照中国猪瘟石门株兔化弱毒全长序列,在猪瘟兔化弱毒活疫苗基因组5'非编码区设计1对标准品引物、1对特异性引物和1条探针,建立检测猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法.该方法检测的敏感度达1.20×10⁵拷贝/mL;对猪繁殖与呼吸综合征、猪乙型脑炎、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病4种活疫苗基因组扩增结果均为阴性;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.29%～0.39%,批间变异系数为0.32%～0.61%.应用此方法对6个不同厂家生产的7种猪瘟兔化弱毒活疫苗中病毒含量进行了检测,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量存在较大差异.结果表明,建立的猪瘟兔化弱毒疫苗实时荧光定量RT-PCR方法能特异地检测疫苗病毒含量,可用于初步评价猪瘟兔化弱毒疫苗抗原含量.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗(TJM-F92株)安全性调查及有效性和干扰性试验

为了解我国高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗(TJM-F92株)的安全性、有效性,以便进一步优化免疫程序,利用ELISA抗体检测与现场跟踪调查的方法,进行了弱毒疫苗(TJM-F92株)安全性调查及有效性和干扰性试验。结果显示:弱毒疫苗(TJM-F92株)对母猪的采食量、体温、返情率及死胎与木乃伊胎数量均无影响,免疫后各阶段猪群的免疫抗体均达到了合格水平;弱毒疫苗(TJM-F92株)与猪瘟疫苗(脾苗)同时免疫,两种疫病的抗体水平均表现正常,与分开免疫无明显差异。结果表明,弱毒疫苗(TJM-F92株)具有良好的安全性和有效性,普免不会使母猪出现不良反应,对各阶段猪群都有良好的保护性,同时可与猪瘟脾苗联合免疫。因此,猪场可以按程序对各阶段猪群开展弱毒疫苗(TJM-F92株)免疫,同时可以尝试与猪瘟疫苗同时免疫,以优化猪场免疫程序,节省人力,减少应激。