山羊地方性鼻内肿瘤病毒gag蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)gag蛋白和抗gag蛋白的多克隆抗体,根据GenBank已登录的ENTVgag基因序列,设计合成1对特异性引物,应用PCP扩增gag基因并连接于原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-gag,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达相对分子质量约为69 000的重组蛋白,重组蛋白经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western blot试验表明,重组蛋白能与制得的多克隆抗体反应,而与正常小鼠血清和山羊地方性鼻内肿瘤患羊血清不反应。本试验成功获得了纯化的ENTV gag蛋白和小鼠抗gag蛋白的多克隆抗体,为进一步研究gag蛋白在ENTV致病过程中的作用提供了材料。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列分析及其gag基因促肿瘤发生的机制研究

本研究旨在获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒（enzootic nasal tumor virus 2,ENTV-2）全基因组序列并进行分析。从福建某羊场的山羊鼻内肿瘤组织取样,针对ENTV-2设计引物,通过RT-PCR方法从肿瘤组织中分段扩增出6个特异性产物,测序后利用生物学软件DNAStar进行拼接,获得长度为7 443 bp全基因组序列,将其命名为ENTV-2-FJ。ENTV-2-FJ基因组结构与其他逆转录病毒类似,具有5'-U5-gag-pro-pol-env-U3-3'典型结构,包含4个开放阅读框和侧翼非编码区以及末端重复序列。为制备兔抗ENTV-2 gag蛋白多克隆抗体,将特异性扩增的gag基因克隆至pET-21a （+）载体,构建重组质粒pET-21a-gag,鉴定后转化至BL21（DE3）细胞并经IPTG诱导成功表达分子量约为70 ku的融合蛋白。Western blot分析表明,制备的兔抗gag蛋白抗体能在患病山羊肿瘤组织和表达gag基因的细胞中特异性地检测出gag蛋白。为了深入研究ENTV-2-FJ致瘤机制,作者构建了过表达gag基因的K562细胞系,并进行裸鼠致瘤试验。结果显示, gag蛋白通过激活JAK2-STAT5信号通路促进肿瘤的生长。综上,本研究获得了ENTV-2-FJ全基因组序列并对其进行分析,制备并验证了gag蛋白的多克隆抗体,揭示了gag蛋白的作用机制,这些结果为阐明ENTV-2的致病机制提供了科学依据。     

大肠杆菌多重耐药调控基因evgS的克隆及其原核表达

以大肠杆菌ATCC25922的基因组为模板,根据GenBank中大肠杆菌的evgS基因序列设计引物,PCR扩增出约894 bp的基因片段,将所得片段与pMD18-T simple vector连接,转化至大肠杆菌JM109中,筛选阳性克隆,其质粒中插入序列测序结果与GenBank中报道一致.提取阳性克隆质粒,经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,回收目的片段,定向克隆到pET-28a原核表达载体中,提取阳性质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实,pET-28a-evgS可成功地在大肠杆菌中表达EvgS蛋白.Western-blot检测证明,表达产物具有良好的反应原性.     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2截短基因的克隆及原核表达

参照GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type 2，PCV2）的ORF2基因序列，设计合成1对引物，对PCV-2ZS株ORF2基因上含主要抗原位点的片段（ORF2-ME）进行PCR扩增，并克隆到pMD18-T Simple Vector中，进行序列测定。将重组质粒pMD—ORF2-ME的EcoR Ⅴ和Xhol Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pET-32a（＋），构建原核表达载体pET—ORF—ME。测序分析表明，克隆的ORF2-ME与GenBank上公布的PCV2毒株核苷酸序列同源性为99％～100％，推导的氨基酸序列同源性介于91％～100％之间。原核表达载体导入BL21（DE3）后用IPTG进行诱导表达，收集菌液进行SDS—PAGE和Western Blotting分析，结果表明ORF2-ME在BL21（DE3）中成功表达，所表达融合蛋白的相对分子质量约为40000，并能被PCV2阳性血清所识别，这就为PCV2感染诊断和抗体检测提供了依据。     

猪圆环病毒Ⅰ型ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型（PCV1）ORF1基因序列,设计合成了1对引物,对PCV1 ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因（939 bp）克隆入pMD18-T载体,将筛选获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。测序分析表明,克隆的ORF1与广东分离株DQ659154的核苷酸序列同源性高达99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.4%。将ORF1双酶切产物插入原核表达载体pET-41a,得到的重组子命名为pET-ORF1。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,PCV1ORF1在pET-41a中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为67.6 ku。     

一起山羊地方性鼻内肿瘤的诊断

陕西省某山羊养殖场发生一起山羊鼻内肿瘤病,通过流行病学和临床症状调查、病理剖检、病理切片检查进行初步诊断。其次根据GenBank收录的山羊地方性鼻内肿瘤病毒基因组序列设计1对特异性引物,通过PCR方法从肿瘤组织中扩增获得目的片段并测序。序列比对分析表明,该目的基因和山羊地方性鼻内肿瘤病毒高度相似,最终确定该病为山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的山羊地方性鼻内肿瘤(ENT)。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015株全基因组cDNA文库的构建及生物信息学分析

为获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)古田株(暂命名为:ENTV/CH/GT/2015株)全基因组序列。通过PCR方法从山羊鼻内肿瘤组织中分段扩增获得ENTV-2全基因组7个片段,目的片段经胶回收后分别连接至pMD19-T载体上,并转化至基因工程菌DH5a,提取阳性质粒进行测序,利用生物学软件对获得的序列进行拼接分析。获得ENTV/CH/GT/2015株全基因组序列长度为7 506 bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及5′端非编码区,并上传至GenBank上获得登录号为MK210250.1;与国外NC004994.2株和AY197548.2株核苷酸同源性均为87.5%,与国内ENTV-2CHN8株核苷酸同源性为97.7%。氨基酸序列分析结果显示,gag蛋白在124～126 aa插入GVE 3个氨基酸和229～232 aa插入APPP 4个氨基酸,env蛋白在590～593 aa处存在AESL 4个氨基酸的缺失;gag和env蛋白抗原表位分析结果显示,尽管存在氨基酸的突变和缺失,但抗原表位并没有明显差异。糖基化位点预测结果显示:gag、pro、pol和env蛋白分别含有1,1,4,6个糖基化位点,均可能不包含信号肽。遗传进化树分析结果推测,该毒株是国内ENTV-2CHN2株和ENTV-2CHN10株变异毒株。本研究获得ENTV/CH/GT/2015株全基因序列并明确其生物学特性,不仅丰富了ENTV-2全基因序列库,还为今后研究ENTV-2快速检测方法及致病机理提供了研究素材。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计合成了一对引物,对PCV1ORF2基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF2基因(702bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒命名为pMD-ORF2。由于ORF2前面有120多个信号肽和序列中有大量的稀有密码子,所以将ORF2进行改造并将改造的ORF2双酶切产物插入原核表达载体pET-32α与pET-41α,得到重组子命名为pET-ORF2-1与pET-ORF2-2。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Westernblot分析,结果表明PCV1-ORF2在pET-32α和pET-41α中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为30Kda和45Kda。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒的gag基因克隆及分析

安徽省某山羊场内部分羊只发生羊鼻漏,面部一侧肿胀,进行病理剖检观察后,取面部皮下肿瘤组织研磨,提取RNA,用特异性引物通过RT-PCR方法扩增获得目的片段并测序。序列比对分析表明,获得的目的基因和山羊地方性鼻内肿瘤病毒的同源性最高,达99%。结果显示,此羊场的山羊感染了由山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的山羊地方性鼻内肿瘤。     

大肠杆菌多重耐药调控基因marR的克隆及其原核表达

为获得MarR多克隆抗体,试验以大肠杆菌ATCC25922基因组为模板,根据GenBank中大肠杆菌的marR基因序列设计引物,PCR扩增出长约435bp的marR基因片段,将所得片段与pMD18-T载体连接,转化至JM109大肠杆菌中,筛选阳性克隆,其质粒中插入序列的测序结果与GenBank中报道一致,从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ酶切回收435bp的目的片段,定向克隆到pET-28a(+)表达载体中,提取阳性质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中获得阳性克隆。结果表明:经IPTG诱导阳性菌收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实marR基因得到表达;经Western-blot检测该蛋白具有良好的反应原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达

用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3) pLacⅠ感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315 bp的片段,重组蛋白大小约为29 ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2 ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株ORF6基因的克隆及原核表达

从河北沧州分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经4代盲传,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为HB-3(cz)株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF6基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物(P1/P2),用RT-PCR方法扩增完整ORF6基因,将扩增产物连接到pGM-T载体并转化克隆菌,阳性重组质粒PGM-M进行序列测定与分析。后将克隆质粒PGM-M双酶切后连接原核表达载体pET-32a(+),在Rosseta-DE3中成功获得表达,经Western-blotting分析表明,表达蛋白与阳性血清发生特异性反应。     

猪圆环病毒2型ORF1基因的克隆与原核表达

为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni²⁺离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因的克隆及其表达载体的构建

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因的表达,研究参照GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株(PRRSV Guizhou-1)的核苷酸序列,利用DNASTAR、Oligo6.0和Primer Premier 5.0软件设计1对ORF5基因的特异性引物,同时将贵州大学动物科学学院分子生物学实验室分离、保存的PRRSV Guizhou-1接种于Marc-145细胞,产生明显细胞病变后收集病毒,用Trizol法提取总RNA进行RT-PCR扩增后获得目的基因,并将其克隆于质粒pMD18-T载体后转入大肠杆菌Top10细胞中,然后分别克隆于原核表达载体pET-32a(+)和真核表达载体pcD-NA3.1(+)中,再进行抗性筛选、酶切鉴定和序列测定.结果表明:得到含有目的基因的阳性克隆,成功构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因原核表达载体pET-ORF5及真核表达载体pcDNA-ORF5.     

猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达

用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3)pLacⅠ感受态细胞,1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315bp的片段,重组蛋白大小约为29ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因的克隆与表达

根据GenBank猪圆环病毒2型基因序列,设计合成两对特异性引物,对厦门株-1进行PCR扩增,得到ORF1和ORF2基因。将PCR产物酶切后,插入到pET-22b载体中,构建原核表达载体pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE_3),经IPTG诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE分析。确定重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni~(2 )离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,逐步透析法进行复性。Western blot和ELISA分析结果表明Rep蛋白和Cap蛋白均能与猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计合成一对引物,应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因(N基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF7重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF7基因序列进行分析。结果表明,ORF7基因的原核表达载体构建成功。ORF7基因序列与美洲型的ORF7基因核苷酸同源性为92.8%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为65.3%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为92.0%～99.2%,与LV株的同源性为65.3%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。本研究为N蛋白的进一步研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌rfaD基因的克隆及原核表达

rfaD基因编码ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶,缺失该基因会导致LOS糖链缩短和疏水性增强,从而影响细菌的致病性。为进一步探索副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)ADP-L-甘油-D-甘露庚糖-6-异构体酶的功能,本研究对Hps SC096 株rfaD基因进行克隆及原核表达。根据GenBank上登录的NC_011852序列,设计引物扩增rfaD基因,获得927 bp目的片段,将其克隆至pMD19-T载体。经送样测序鉴定正确后,连接到pET-32a(+)上进行原核表达,并用IPTG诱导,将诱导产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,H.parasuis rfaD基因能在E.coli BL21(DE3)中表达,重组蛋白分子质量约为50 ku,与预期分子质量大小一致。Western blotting分析结果表明,该蛋白质能与H.parasuis血清4型阳性高免血清产生特异性结合反应,具较好的反应原性。     

细粒棘球蚴GST-mu2基因的克隆、表达及重组蛋白反应原性研究

为了研究细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)谷胱甘肽S-转移酶mu 2(GST-mu 2)蛋白的反应原性,根据GenBank中Eg GST-mu2基因cDNA序列设计特异性引物,以Eg头节总RNA为模板,进行RT-PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体,测序验证后,将GST-mu2基因亚克隆至表达载体pET-28a中,构建pET-GST-mu2原核表达载体,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对表达蛋白进行反应原性分析。结果表明,GST-mu2cDNA全长660个核苷酸,编码219个氨基酸,该多肽含有2个N端酰基化位点,2个PKC磷酸化位点,3个CKⅡ磷酸化位点,1个TYR磷酸化位点,抗原表位区集中在28~70、147~219位;SDS-PAGE可以检测到32kDa的蛋白特异性条带;Western blot分析显示,表达的pET-GST-mu2重组蛋白能与Eg阳性血清发生特异性反应,具有较强的反应原性,为进一步利用GST-mu2蛋白作为Eg感染诊断的候选抗原奠定了基础。