半滑舌鳎性腺分化的组织学观察

运用组织学方法,对半滑舌鳎性腺的发育和分化过程进行了观察。半滑舌鳎的性腺发育为雌雄异体的分化类型,可以分为3个阶段:性腺的原始阶段、性腺分化前期阶段和性腺分化完成阶段。在50日龄以前,原始性腺形成但未分化。62日龄,个体达到40.5mm时,一种性腺形成了成簇发育的原始细胞群,性腺迅速增大变宽,后来发育成为卵巢;另一种仍处于休止阶段,相对较小,后来发育为精巢。雌鱼在120日龄形成明显的卵巢腔,开始了细胞学的分化;精巢在100日龄精原细胞开始快速增殖,体细胞有丝分裂,形成输精管原基,在150日龄左右开始细胞学的分化,并形成精小叶,190日龄左右出现初级精母细胞,性腺分化基本完成。雌鱼性腺分化时期早于雄鱼。     

温度对半滑舌鳎家系生长及性别的影响

以建立半滑舌鳎家系为研究材料,在受精后46 d,将家系在17.5、19.5、21.5、23.5、25.5和27.5℃6个温度梯度下培育65 d;分别在受精后64、80、103、118、129、198 d测量各温度梯度下半滑舌鳎鱼苗体长和体重,利用方差分析、Student-Newman-Keuls多重比较,分析半滑舌鳎家系鱼苗的生长规律及培育温度与体长和体重的相关性。结果显示,在以上温度范围内鱼苗的生长速度随温度的升高而加快,在198 d以后,25.5℃下鱼苗生长最快(P<0.05),21.5～23.5℃次之(P<0.05),27.5℃生长下降(P<0.05),17.5～19.5℃生长最慢(P<0.05)。在17.5～27.5℃,温度与半滑舌鳎家系生长体长、体重的Pearson系数分别为0.553和0.809,都达到极显著正相关(P<0.01)。体长、体重与温度关系式分别为L=2.460 7t0.9979(R2=0.362 8)和W=9.0×10-5t2.976(R2=0.789 5)。在198 d解剖统计各温度梯度下雌雄比例,同时固定30尾鱼苗性腺,利用光学切片法辨别并统计雌雄性别比例,对获得的性别比例进行方...     

半滑舌鳎性腺的组织学研究

采用组织切片,对半滑舌鳎性腺的组织学结构进行了观察研究。结果表明,半滑舌鳎的精巢为小叶型,精巢内的生殖细胞分为五种。其精原细胞存在于精小叶的内壁上,精母细胞和成熟的精子细胞位于精小囊中。精子成熟后,精小囊破裂释放精子进入小叶腔,完成发育过程。半滑舌鳎卵巢外有被膜包裹,其被膜的结缔组织可明显地分为内外两层。内层的结缔组织、血管与原始生殖细胞一同伸进卵巢内部形成许多产卵板。产卵板以卵巢腔为中心向四周呈辐射状排列,上有原始生殖细胞分化形成卵原细胞和不同时相的卵母细胞。半滑舌鳎卵巢中的卵母细胞的发育可以分为5个时相。本文描述了各时相卵母细胞的形态学特征。并阐述了半滑舌鳎的产卵类型。     

温度对鱼类性别分化和性别决定的影响

哺乳类和鸟类的胚胎发育在恒温条件下进行的,受外界环境影响极小,因此其性别决定和分化主要由遗传因素决定。而低等脊椎动物的性别决定和分化除受遗传因素控制外,还受到温度、光照、pH值、食物供给、外源激素及动物群体行为等多方面因素的影响。     

水温对半滑舌鳎性腺组织发育的影响

探讨了不同温度(19,21,23,25和27 ℃)对半滑舌鳎的性腺组织发育的影响。在受精后39～106 d对半滑舌鳎进行温度控制处理,通过石蜡组织切片,对半滑舌鳎早期性腺分化发育进行组织学观察。发现在19 ℃饲养条件下,受精后46 d(pfd46)半滑舌鳎性腺原始生殖细胞数量增加,有分化成卵巢的倾向;在该条件下,pfd82半滑舌鳎性腺开始分化为精巢。pfd82时,27 ℃条件下的幼鱼卵巢中卵原细胞数目大量增殖;精巢中精小叶多而密,结缔组织间隔清晰。pfd129时,27 ℃处理的幼鱼卵巢发育到Ⅱ期,其他温度处理组仍处于Ⅰ期卵巢,但随着温度的提高,卵巢中卵母细胞数目增多,且由散乱分布变为有序的排列在卵巢小叶中;精巢中贮精囊数量增多,囊腔中精子增多。pfd142时,高温处理组幼鱼性腺发育最快,其Ⅱ期卵巢中卵母细胞数目最多,精巢中后期生精细胞偏多,精子几乎分布到各个精小叶中,且贮精囊结构发达,内纳高密度精子,在周围输精管中也分布着精子。结果表明,温度影响了半滑舌鳎性腺发育程度,二者呈现线性关系,在适当温度范围内,性腺发育速度随着温度升高而加快。     

半滑舌鳎苗种对温度和盐度耐受性试验

采用自然降温和人工升温、降低盐度的方法,测定了不同规格半滑舌鳎苗种对温度和盐度的耐受性.结果表明:越冬池底层水温保持在2℃以上,规格8～15 cm鱼种成活率为78.6%,规格22～26 cm鱼种成活率为90%.在每日升高1℃的情况下,水温升至30℃时半滑舌鳎苗种摄食明显减少,32℃时出现死亡;保持32℃水温条件,5 d全部死亡,由此,半滑舌鳎存活温度为2～31℃.在海水盐度每天下降2‰～3‰的情况下,保持盐度在5‰以上,半滑舌鳎苗种可正常摄食、生长,生长速度与对照组无显著性差异,说明半滑舌鳎适宜低盐度养殖.     

外源激素对半滑舌鳎早期性腺发育及生长的影响

为探讨外源激素对半滑舌鳎性腺发育、体长增长及存活率的影响,用雌二醇和甲基睾酮分别处理半滑舌鳎幼鱼,各设200μg/L,400μg/L,500μg/L三个浓度进行浸浴处理,以乙醇处理作为阴性对照组,未做任何处理的作为空白对照组,统计各组存活率并在实验的不同时间段分别观察实验鱼的体长的变化;激素处理30 d后,每隔5 d每组取样5尾,通过组织学H.E染色观察各实验组幼鱼性腺的发育情况。结果表明,在甲基睾酮和雌二醇的诱导下,半滑舌鳎幼鱼的生长情况均受到一定程度的抑制,雌二醇在半滑舌鳎幼鱼发育早期对其卵巢发育具有一定的促进作用,而甲基睾酮则起到了抑制的作用。     

半滑舌鳎Dmrt1蛋白表达、纯化及功能

通过分析半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) Dmrt1重组蛋白注射卵巢后基因表达调控, 探讨Dmrt1在半滑舌鳎性别决定与分化中的功能。实验利用原核表达系统(Pet-32a)对半滑舌鳎Dmrt1基因进行重组表达, 并通过亲和层析纯化获得了重组目的蛋白(Pet-32-dmrt1)。重组蛋白注射卵巢后实时定量PCR分析结果显示, Cyp19a和Foxl2在6～24 h内两基因表达量均显著下调, Sox9a基因表达量在6～24 h内有显著上调, 但48 h后3个基因的表达量逐渐恢复正常表达水平。研究结果证实, Dmrt1重组蛋白具有生物活性, 且对性别相关基因表达调控具有一定的影响, 在性别决定中发挥一定作用。

     

影响半滑舌鳎生长发育的水环境因素

采用亲鱼强化培育、药物人工催产、自然产卵受精、人工授精、水泥池微流水孵化及鱼苗室外池塘培育方式,进行了锦鲤的亲鱼培育与规模化人工繁育,试验取得了良好的效果。采用LHRH-A3与DOM混合胸腔一次注射法催产140组锦鲤亲鱼,结果138尾雌鱼顺产,孵化出仔2500万尾。对230万尾仔鱼进行了规模化培育,共培育出3～5cm长的苗种150万尾,成活率65．2％。50万尾夏花鱼种经3次挑选,按照业内分级标准,选留了5万尾优质鱼种,其背部挺直,色彩鲜艳,图案斑纹清晰,品种特征明显。     

半滑舌鳎早期不同性别的形态差异及判别分析

为检验半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)鱼苗70日龄时不同性别间的形态差异,对采集的349尾半滑舌鳎幼苗准确鉴定性别,并测量形态性状,进行数据分布检验、方差分析、主成分分析和判别分析等.结果显示,所测各性别群组的形态指标数据均符合正态分布、方差齐性(P>0.05).对半滑舌鳎形态学性状的方差分析和...     

半滑舌鳎养殖群体的性比与雌雄形态差异比较

为研究半滑舌鳎养殖群体幼鱼阶段的性比变化,实验用分子标记法鉴定半滑舌鳎遗传性别,用组织切片方法鉴定表型性别,并比较了表型雌雄的生长差异。结果发现,在半滑舌鳎幼鱼阶段,在遗传性别上,雌雄所占比例约为1∶1,差异不显著(P>0.05)。在表型性别上,雌雄比例约为1∶3,差异极显著(P<0.01)。表型雄性中,由遗传性雄性和遗传上为雌性而表型上为雄性的"伪雄鱼"两部分组成。在养殖群体中,表型雌性、伪雄鱼和雄性三者的比例大致为1∶1∶2。养殖现场反映的雌性约占1/4的情况与本研究结果基本一致。本研究没有发现遗传上为雄性,而表型上为雌性的个体。在6～8月龄间,伪雄鱼的全长、体质量处于表型雌性与正常雄性之间,与两者均无显著差异。在相似全长范围内,雄鱼体高小于雌鱼,雄鱼的全长/体高的平均值为4.05,雌鱼的平均值为3.89,雄鱼的全长/体高比值显著大于雌鱼(P<0.05),此比值可以作为区分雌雄鱼苗种的参考。     

温度对半滑舌鳎生长及性类固醇激素水平的影响

为了探索温度对半滑舌鳎幼鱼生长及性别的影响,本研究以半滑舌鳎家系为材料,在受精后32 d,将建立的家系鱼苗分别置于9、21、23、25和27℃水温下进行培育,在32~142 dpf测量各培育温度下半滑舌鳎幼鱼的体长和体质量,利用SPSS软件中方差分析和相关分析法多重比较分析幼鱼生长规律、温度与体长和体质量的相关性。结果表明,在98 dpf时,25℃下幼鱼生长最快,但培养至129~142 dpf时,23℃温度组生长速度显著高于其他温度组。23和25℃下的半滑舌鳎体质量特定生长率分别为4.42%和4.63%,明显高于其他温度处理组。温度与半滑舌鳎家系体长、体质量的Pearson系数分别为0.271和0.260,极显著正相关。体长、体质量与温度的关系式分别为L=1.637 6T0.378 2(R2=0.082),W=0.028 5T1.078 1(R2=0.075)。采集23℃下半滑舌鳎受精卵和3~142 dpf的鱼苗,进行性类固醇激素表达水平分析。结果显示,睾酮(T)和雌二醇(E2)含量在受精卵中最高(54.78 ng/mg和92.52 pg/g),3~32 dpf时逐渐降至最低值(4.6 ng/mg和5.43 pg/g)。至46 dpf时又显著上升到峰值[(40.81±12.64)ng/mg和(42.04±19.13)pg/g],之后显著下降。在温度控制组,32~46 dpf各个温度组鱼苗T和E2含量显著上升,46 dpf时达到峰值,但19和21℃温度组显著高于其他组,T分别为(94.70±45.06)和(85.45±37.30)ng/mg,E2分别为(83.37±17.97)和(105.80±54.90)pg/g;其他温度组T和E2含量相对较低且无显著差异。98 dpf性类固醇激素表达量显著下降,各温度组E2水平无显著差异,但19和27℃时T水平高于其他温度组。依此推测46 dpf、体长(4.99±0.75)cm时半滑舌鳎鱼苗性腺开始分化,19和27℃有可能促使鱼苗雄性化。     

半滑舌鳎染色体核型分析

The tonguefish Cynoglossus semilaevis (Giinther) is a rare fish species in Chinese offing, inhabiting in the warm water bottom. The metaphase chromosome preparation of the fries has been got from their fins by hot air drying methods, while the metaphase chromosomes of one year old young fish which has physiologically sex differentiation has teen got from their renal tissues by the method of PHA and colchicine injection. The karyotypes were examined. The result shows that there are 42 acrocentric chromosomes in diploid and their karyotype formula is 2n = 42t, and there existed heterotypic sex chromosome which belongs to ZW/ZZ type. The sex ratio in artificial bred stock is nearly 1 : 1.     

半滑舌鳎胚胎发育及其与水温的关系

2002年8～9月在山东莱州明波水产公司养鱼场,半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther, 1873)亲鱼经人工诱导催熟,在亲鱼培养池中雌、雄个体同时排卵、排精并完成了自然授精.卵子受精后,对受精卵进行连续的取样,在Nikon SMZ-10双筒解剖镜下观察胚胎发育的全过程.培养水温20.5～21.6 ℃,盐度33.50,pH 7.8～8.6,受精卵1 h 30 min细胞开始分裂,4 h 5 min为多细胞期,5 h 0 min为囊胚期,22 h 20 min胚孔关闭,40 h 20 min仔鱼开始孵出.根据本次实验以及1982年、1987年、1989年和2002年8月进行的半滑舌鳎人工孵化实验结果,应用3种数学统计方法,从理论上对半滑舌鳎胚胎发育的阈温度和有效积温值进行计算,结果表明,半滑舌鳎胚胎发育的阈温度和有效积温分别为13.2 ℃和347.0 ℃·h.     

半滑舌鳎 Gadd45g3 基因的克隆与表达分析

生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(growth arrest and DNA damage inducible protein 45,Gadd45)基因在胚胎发育和性别决定中起重要作用。本研究通过RACE方法在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆得到了1个Gadd45g同源基因,命名为Gadd45g3。该基因全长1 147 bp,编码155个氨基酸残基。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Gadd45g3与其他鱼类Gadd45g-like的同源性为79%~88%,与硬骨鱼和高等脊椎动物的Gadd45g同源性为58%~67%。对多个物种的Gadd45g同源基因的CDS区进行Ka/Ks分析,发现Ka/Ks均小于0.3。FISH结果显示,半滑舌鳎Gadd45g3基因位于常染色体上。实时荧光定量PCR结果显示,Gadd45g3在雌雄成鱼的脑中都有很高的表达,说明其参与了神经发育;在成熟性腺中,Gadd45g3的表达具有精巢特异性,说明Gadd45g3是性别相关基因;而在不同发育时期的性腺中,Gadd45g3的表达量在孵化后20 d的雄性仔鱼中显著高于同龄雌鱼(P0.05),但在孵化后95 d的雌雄仔鱼中均有高表达,说明在半滑舌鳎性别决定和性腺发育中起着重要作用。     

半滑舌鳎 WT1a 基因的克隆与性别分化期的表达分析

从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组序列中获得肿瘤抑制基因 WT1a 的部分序列, 然后利用 RACE 技术克隆了WT1a 基因的全长, 运用组织学方法, 对半滑舌鳎性腺分化早期的组织切片进行了观察, 并分析了该阶段WT1a 的表达特征。克隆结果显示, WT1a 基因cDNA全长为1 886 bp, 开放阅读框(ORF)长为1 470 bp, 编码490个氨基酸, 并且包含 KTS 三肽, 5′-UTR 和3′-UTR 分别长为245 bp 和171 bp。在 ORF 末端发现2个微卫星(SSR)序列和2个跨膜螺旋区域, 而在其他物种中未发现这些区域。氨基酸序列分析显示, WT1a 基因的保守性很高, 与人的同源性高达90%。通过组织切片观察发现, 该批半滑舌鳎在56 d时性腺开始分化, 并且卵巢分化早于精巢。荧光实时定量分析结果显示, WT1a 在半滑舌鳎成鱼性腺中表达量显著高于其他各组织, 在肝、肾、脾、心脏等组织中有微量表达, 并且在成鱼性腺中, 雄鱼表达量显著高于雌鱼, 雌鱼显著高于伪雄鱼。在胚胎发育各时期以及初出膜后WT1a的表达结果显示, 在12 h (原肠早期)显著升高, 20 h (神经胚期)达到最高。在性腺分化早期雌雄性腺中的表达结果显示, WT1a 在雌雄半滑舌鳎16~66 d 的性腺中表达量持续平稳升高, 在性腺分化时期表达量并没有特殊的变化。这些研究结果说明, WT1a 基因是半滑舌鳎性别相关基因, 并在半滑舌鳎的性腺分化、发育过程中持续表达, 但可能对性腺的分化过程并不起决定作用。

     

半滑舌鳎精子冷冻保存

半滑舌鳎精子冷冻保存对于人工繁殖育苗、杂交育种、雌核发育及其性别控制研究具有重要的意义,为此,本文对半滑舌鳎精子冷冻保存方法进行了研究。分别利用2．8mol／L的二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Gly）和1,2-丙二醇（PG）冷冻保存该鱼精子。结果显示,DMSO冷冻保存精子的活力较高。利用MPRS＋2．8mol／L DMSO以1：0．5、1：1、1：1．5和1：2的比例稀释并冷冻精子,1：1比例在冻前能够抑制精子的运动,冻后活力可达82．50±3．54％,显著高于其他稀释比例（P〈0．05）。分别利用冷冻保存液A（MPRS＋2．8mol／L DMSO）和B（TS-2＋2．8mol／LDMSO）稀释平衡精子,精子在A中的冻前快速运动时间、寿命分别为37．75±6．45S和145．00±78．98S,与鲜精无显著差异（P〉0．05）。利用以上两种冷冻稀释液冷冻保存精子,精子在A液中的冻后活力和寿命分别可达53．50±6．69％和98．00±13．51s,冷冻效果优于B液（P〈0．05）。冷冻后精子的受精率和孵化率分别为55．00±5．00％和35．00±13．23％,受精率与鲜精无显著性差异（P〉0．05）,因此认为MPRS＋2．8mol／L DMSO可用于半滑舌鳎精子的冷冻保存。