微波诱变选育γ-亚麻酸高产菌株

采用微波处理方式,对产γ-亚麻酸的一株雅致小克银汉霉D5进行诱变处理,选育得到一株高产γ-亚麻酸的菌株D5-89.与出发菌株相比,该菌株γ-亚麻酸含量在油脂中的比例从10.31%提高到19.76%;发酵液中γ-亚麻酸的产量从0.3648 g/L提高到0.6832 g/L,提高了87.28%.该性状经过10次传代仍保持稳定.     

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)基因cDNA克隆及其植物表达载体构建

山梨醇是一种糖醇,是蔷薇科木本植物主要的光合产物及贮运物质,6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)是其合成的关键酶(马锋旺和李嘉瑞,1993)。近年来,人们利用基因工程手段将S6PDH cDNA导入烟草(Tao et al.,1995)、柿(Gao et al.,2001)中,发现转基因植物可合成山梨醇,且使转基因植物抗性     

杨树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）基因启动子的克隆与分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶,其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH,也为核酸合成提供戊糖;此外,还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此,G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。本文利用甜杨G6PDH基因和毛果杨基因组序列,通过PCR获得了甜杨G6PDH基因上游1400bp的序列。序列分析结果表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box。此外,还包含多个胁迫诱导元件,如低温诱导元件LTR,盐诱导元件GT-1,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件MYB和MYC,以及光响应元件L-box、G-box、3AF-1、TC丰富区等。     

奶山羊超长链脂肪酸延伸酶6基因(ELOVL6)的克隆及其对4个脂肪酸代谢基因表达水平的影响

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)是长链脂肪酸延长反应的限速酶。本研究旨在通过对奶山羊(Capra hircus)ELOVL6基因的克隆、组织表达分析以及腺病毒(Adenovirus)介导的超表达技术,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响。利用RT-PCR技术克隆了奶山羊ELOVL6基因的CDS区;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因在泌乳期奶山羊10个组织中的相对表达量;构建该基因的重组腺病毒超表达载体,包装出高滴度的腺病毒并感染奶山羊原代乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测ELOVL6超表达效果及其对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明,ELOVL6基因CDS区序列长度为795 bp(GenBank登录号:KF667508),共编码264个氨基酸。同源分析发现,奶山羊ELOVL6基因CDS区核酸序列与牛(Bos taurus)、大鼠(Rattus norvegicus)和人(Homo sapiens)的同源性分别为97%、90%和93%,氨基酸序列同源性分别为99%、92%、95%。利用TMpred对ELOVL6蛋白跨膜结构预测分析,发现该蛋白有5个跨膜区,保守的组氨酸模体(HXXHH)位于ELOVL6蛋白的第二与第三跨膜螺旋间。ELOVL6蛋白质疏水性预测显示,该蛋白总体具有较强的疏水性。组织表达分析显示,ELOVL6基因在脂肪组织中表达量最高(P0.01),小肠次之(P0.01),心脏中表达量最低。超表达ELOVL6基因的重组腺病毒的滴度为108U/mL,病毒液感染原代乳腺上皮细胞48 h后,ELOVL6基因的表达量上升约200倍;脂肪酸代谢相关基因检测分析发现,固醇调节元件结合蛋白-1基因(SREBP-1)的表达量显著下降(P0.05),脂肪分化相关蛋白基因(ADRP)的表达量显著升高(P0.05),过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因(PPARγ)及脂肪酸转位酶基因(CD36)的表达量无明显变化。研究结果表明,ELOVL6基因可以影响奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢相关基因的表达,对乳腺脂肪酸代谢具有一定的调控作用。本研究为ELOVL6基因在奶山羊乳腺脂肪酸代谢调控中的功能研究提供研究依据。     

鲈鱼6-磷酸葡萄糖酶催化亚基(G6PC)cDNA和5’侧翼序列的克隆及分析

6-磷酸葡萄糖酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase,EC 3.1.3.9)催化6-磷酸葡萄糖水解产生磷酸和葡萄糖,即糖异生途径和糖原分解途径的最后一个限速反应.我们用SMART RACE技术从鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)肝脏中克隆了6-磷酸葡萄糖酶催化亚基(glucose-6-phosphatase catalytic subunit,G6PG)基因cDNA序列.该序列全长1651 bp,5’端非翻译区75 bp,3’端非翻译区496 bp,开放阅读框1080bp,可编码一个由359个氨基酸组成的蛋白,该蛋白理论分子量40.45kD、等电点9.30(GenBank登录号:HQ317736.1).氨基酸序列分析表明,鲈鱼G6PC与胡瓜鱼(Osmerus mordax)、翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis)、慈鲷(Haplochromis nub ilus)、斑马鱼(Danio rerio)、黑青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)、金头鲷(Sparus aurata)、非洲爪蟾(Xenopus laevis、牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)及大鼠(Rattus norvegicus)11个物种的同源性达58％以上,其中与胡瓜鱼同源性最高,为85％.RT-PCR分析G6PC基因在鲈鱼肌、心、眼、脑、鳃、肝、肠、肾、脂和脾10个组织中的表达,在肝、肠和肾中有较高的表达,在脑和鳃只有微弱的表达.用基因组步移技术克隆了G6PC基因的5’侧翼区的序列1 243bp,表明该序列含有2个TATA box位点,2个胰岛素作用序列(insulin response sequence,IRS)及C/EBPb、CRE-BP、HNF-3b等潜在的转录因子结合位点.本研究结果表明,鲈鱼G6PC基因在肝、肠和肾中有高表达,其5’侧翼区存在多个转录因子结合位点,该结果为研究G6PC基因的表达调控机制提供了基础资料.     

野油菜黄单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的初步分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,对该菌8004菌株全基因组序列进行分析,发现基因组中有两个编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因,编号分别为XC1977和XC4082,同源性分析显示这两个基因演绎的氨基酸序列只有36.3%的相似性。为了解这两个基因的功能,采用自杀质粒pK18 mob对XC1977和XC4082分别进行诱变,构建这两个基因的非极性突变体,对突变体表型初步分析,发现XC1977和XC4082分别突变后不影响细胞的生长繁殖,但对胞外多糖产量的影响则不相同,XC1977突变使胞外多糖产量降低56.3%,而XC4082突变基本不影响胞外多糖产量,表明8004菌株的两个zwf基因在细胞中的功能不同,XC1977与细胞的胞外多糖合成产量有关。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的真核表达及其牛结核病诊断价值评价

本研究旨在利用毕赤酵母(Pichia pastoris)系统融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的培养滤液蛋白10(culture filter protein 10,CFP10)和早期分泌抗原靶6蛋白(earlier secreted antigen target 6,ESAT6),并评价其作为牛结核病外周血γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)体外释放实验特异性刺激剂来诊断牛结核病的应用潜能.通过PCR扩增cfp1 0-esat6融合基因,构建pPICZα A-(cfp10-esat6)重组质粒,电转化毕赤酵母GSll5,添加甲醇至终浓度1.0％,诱导3d,取培养上清进行SDS-PAGE分析,镍离子金属螯合亲和层析柱纯化目的蛋白,Western blot分析重组蛋白的免疫反应性;取纯化的融合蛋白CFP10-ESAT6作为刺激剂用于牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验,评价其牛结核病诊断价值.结果表明,目的蛋白(33kD)被成功分泌表达,该融合蛋白与抗CFP10、ESAT6、组氨酸标签和c-Myc4种单抗均发生特异性反应,具有较好的免疫反应性.165份奶牛外周血样品的IFN-γ检测结果表明,CFP 10-ESAT6融合蛋白与结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)作为刺激剂,二者阳性符合率为82.3％,阴性符合率为78.8％.本研究利用酵母表达系统成功表达CFP10-ESAT6融合蛋白,并表现出更高的生物学活性,在牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验中可作为候选刺激剂,并能克服混合感染导致的PPD漏检问题,从而进一步提高检测的敏感性和特异性.     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

褐藻糖胶对黄颡鱼幼鱼中脂肪酸的影响

为研究褐藻糖胶作为饲料添加剂对黄颡鱼幼鱼脂肪酸的影响,选取大小、体重相近的黄颡鱼幼鱼,随机分为对照组和试验组,对照组饲喂不添加褐藻糖胶的基础饲料,试验组饲喂添加0.1%褐藻糖胶的饲料,采用气相色谱质谱联用技术(GC-MS)分析不同喂养时间(1、2、4、8周)下试验组和对照组黄颡鱼幼鱼脂肪酸含量的变化。结果表明,黄颡鱼幼鱼体内共检测出15个总脂肪酸(TFA)和17个游离脂肪酸(FFA)。方差分析结果表明,黄颡鱼幼鱼TFA中C18:1 (n-9)、C20:4(n-5)和C22:6 (n-3)具有交互作用,而大部分FFA间都存在交互作用。喂养时间对黄颡鱼幼鱼脂肪酸有显著影响(P<0.05),随着喂养时间的延长,游离的单不饱和脂肪酸(MUFA)含量呈先减少后增加趋势,而总MUFA含量呈先增加后减少趋势;黄颡鱼幼鱼游离脂肪酸和总脂肪酸中饱和脂肪酸(SFA)均呈先增加后减少趋势,而多不饱和脂肪酸(PUFA)呈先下降后升高趋势。0.1%褐藻糖胶对黄颡鱼幼鱼TFA中C18:1 (n-9)、C20:4(n-5)和C22:6 (n-3)含量影响显著(P<0.05),对FFA组分含量的影响均显著(P<0.05),试验组黄颡鱼幼鱼SFA含量高于对照组,MUFA含量低于对照组,PUFA在喂养第2周时高于对照组,喂养第8周时低于对照组。此外,黄颡鱼幼鱼C20:3(n-3)/C22:6(n-3)的比值小于0.4,且喂养0.1%褐藻糖胶第8周时,黄颡鱼幼鱼C22:6(n-3)和C20:4(n-5)含量明显高于对照组,说明褐藻糖胶有益于黄颡鱼产卵和孵化,有助于黄颡鱼幼鱼的发育生长。本研究结果为黄颡鱼的健康养殖提供了基础数据。     

γ-氨基丁酸对番茄嫁接苗耐盐性的生理调控效应

[目的]γ-氨基丁酸(GABA)可增强作物品质和抗逆性,但其效果是否受植株根系耐盐性的影响尚不明确。因此,研究添加外源GABA对不同耐盐性番茄嫁接苗的生理调节机制及生长的影响,为小分子氨基酸在蔬菜生产中的应用提供理论依据。[方法]以耐盐性较强的砧用番茄‘OZ-006’为砧木、对盐分较敏感的‘中杂9号’为接穗形成的嫁接苗(RS)为材料,以‘中杂9号’自嫁接苗(SS)为对照材料,进行无土营养液栽培试验。以Hoagland营养液为基础,以调节NaCl浓度至175 mmol/L形成的盐胁迫条件作为对照(CK),在CK基础上设置添加5 mmol/L GABA处理(+G)。从处理后3天起,测定了幼苗生长、Na⁺积累、氨基酸含量及活性氧代谢指标。[结果]随着NaCl胁迫时间的延长,SS和RS幼苗均显著受到盐胁迫伤害,但RS幼苗盐害指数及Na+含量显著低于SS幼苗,其生长速率、叶绿素含量及氨基酸含量显著高于SS幼苗,其O2·-和MDA含量显著低于SS幼苗,表现为耐盐性显著高于SS幼苗。添加外源GABA后,SS和RS幼苗的鲜重、生长速率、叶绿素及氨基酸(GABA、谷氨酸和脯氨酸)含量、抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性均显著提高,根系和叶片内Na+含量、O2·-产生速率及MDA含量均显著降低,且SS幼苗耐盐性提高的效果大于RS幼苗。[结论]盐胁迫显著影响番茄幼苗的生长,尤其对耐盐性弱的品种生长抑制更加显著。γ-氨基丁酸(GABA)可有效提高番茄嫁接苗的耐盐性,主要原因在于GABA为幼苗提供了氮素营养,促进了盐胁迫下植物的生长和叶绿素的合成,同时GABA诱导细胞内多种氨基酸含量上升,叶片渗透调节能力增强,从而抑制了Na⁺过量积累,缓解了细胞内活性氧积累带来的膜伤害。此外,GABA添加对耐盐性弱的番茄嫁接苗耐盐性的提升效果比对耐盐性强的番茄嫁接苗更加明显。因此,在盐胁迫条件下,施用外源小分子氨基酸(如GABA)可能是提高作物耐盐能力的有效措施。     

喷施γ-聚谷氨酸提高夏玉米产量和养分吸收的机制

【目的】探明γ-聚谷氨酸 (γ-PGA) 促进夏玉米生长和养分吸收利用的调控机制,为其在玉米生产中的科学使用提供技术指导和理论依据。【方法】以玉米品种郑单958为试材,于2017和2018年在河北廊坊进行了田间试验。在两个氮肥水平下,即常规用量 (N 180 kg/hm2) 和减量30% (N 126 kg/hm2),分别喷施γ-PGA或谷氨酸两种增效剂 (剂量分别为0、37.5、150 g/hm2),共10个处理。在玉米5个关键生育期采集植株样品,测定植株干物质积累和氮磷钾养分含量,并于收获期测定了玉米籽粒产量。【结果】1) 两种增效剂处理的夏玉米穗粒数、产量、干物质和养分积累量存在显著差异,喷施γ-PGA效果显著优于喷施谷氨酸。与清水对照相比,喷施γ-PGA可通过提高穗粒数来实现增产,干物质积累总量显著增加,且主要促进开花前后的干物质积累,氮磷钾积累总量也有显著增加,两个剂量间无明显差异。喷施谷氨酸与清水对照的效果无明显差异。2) 常规施氮水平下,与清水对照相比,喷施低量γ-PGA干物质积累总量显著增加5.08%,但增产作用不明显;而喷施高量γ-PGA的处理虽然干物质积累总量增加不明显,但穗粒数明显增加,产量显著增加3.42%,两剂量处理氮磷钾积累量均显著增加,增幅分别为5.20%～6.97%、7.29%～10.85%、3.48%～5.27%;减氮30%水平下,喷施高量γ-PGA处理穗粒数提高,产量显著增加3.07%,而低量处理的穗粒数和百粒重均有明显提高,并显著增产,两剂量下干物质和钾积累总量分别显著增加6.48%～7.93%、4.36%～6.12%,而低量处理氮磷积累量分别显著增加8.41%、11.94%,显著高于高量处理。两种施氮水平下,谷氨酸处理各指标与对照均无明显差异。3) 高产年份 (2017年) ,喷施高量γ-PGA显著增产2.54%,低量处理增产不明显,两个喷施剂量均显著增加干物质和氮磷钾积累总量;低产年份 (2018年) ,两个剂量γ-PGA处理的产量均显著增加,增幅分别达4.37%、4.14%,低量处理均显著增加干物质和养分积累量,且显著高于高量处理。对谷氨酸处理而言,仅在2018年低量处理通过增加百粒重使得产量显著增加,但效果低于γ-PGA处理。【结论】喷施γ-PGA促进夏玉米开花前后干物质积累,提高干物质和养分积累总量,增加穗粒数提高产量,而喷施谷氨酸无明显效果。可见,γ-PGA的增产增效并非主要是由于分解的谷氨酸起作用。减氮30%水平下喷施γ-PGA的增产增效作用大于常规施氮,且常规施氮水平下喷施高量γ-PGA的增产效果更好,而减氮30%水平下喷施低量γ-PGA的效果更好,表现为喷施低量γ-PGA处理 > 常规施氮对照 > 减氮30%对照,说明减氮30%下喷施低量γ-PGA能达到减肥增效的目的。     

朗德鹅3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)cDNA克隆及其mRNA在填饲鹅肝组织中表达的研究

本实验旨在获得鹅(Anser anser)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)的cDNA序列,观察该基因的表达与填饲鹅肝脏生成胆固醇的相关性。选用填饲28 d朗德鹅作为实验材料,运用RACE方法扩增目的基因的cDNA序列,利用荧光定量PCR技术检测并分析HMGCS1基因在各组织中mRNA的表达,比较填饲28 d后各组织HMGCS1基因表达的变化,同时选用胆固醇试剂盒测定鹅肝中胆固醇的含量。结果显示,HMGCS1基因的cDNA全长为2 947 bp,开放阅读框编码522个氨基酸(GenBank登录号:KF425515)。荧光定量PCR结果显示,该基因在肝脏中表达显著高于其他组织(P0.05)。填饲28 d后,填饲组肝脏胆固醇含量低于对照组(P0.05),该基因在肝脏中的表达显著降低(P0.05)。氨基酸序列分析表明,HMGCS1基因高度保守,与鸭(Anas platyrhynchos)、鸡(Gallus gallus)、鸽子(Columba livia)等家禽同源性较高。该基因特异性地在肝组织中表达,且该基因的表达与肝脏中胆固醇合成呈正相关。本实验结果为进一步研究HMGCS1基因的功能提供了参考资料。