菠菜性别相关EST-SSR标记的开发及应用

为了明确菠菜EST序列中SSR的总体特点,开发菠菜EST-SSR引物;为利用EST-SSR引物进行菠菜性别相关特异序列的克隆奠定基础,本文从NCBI上获得1093条EST,利用在线软件SSRIT检测所含SSR序列,并进行分析。共检索出68条SSR序列,分布于64条EST中,检出率为6.22%,包括22种重复基元。其中二核苷酸重复基元的EST-SSR占主导地位,占总SSR数目的32.3%。利用在线引物设计软件Primer3.0设计了7对EST-SSR引物,在适合的PCR反应体系下,分别以雌、雄菠菜DNA基因组为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,结果显示以EST序列HS097148设计的一对引物从菠菜雌雄基因组中扩增出一条雄性特异的条带,表明通过菠菜EST-SSR引物获得菠菜性别相关特异序列是可行的。     

三种人参属植物的EST-SSR信息分析及其在三七中的应用

为了解人参属植物EST中SSR分布特点及其在三七SSR标记中的应用,利用生物信息学方法,用primer3软件对dbEST数据库中人参属植物人参、西洋参和三七的EST序列进行搜索,发现人参属植物EST-SSR出现频率为11.54%,平均每4.39kb出现1个SSR。人参属植物单核苷酸重复基元占主导地位,其次为三核苷酸重复基元和二核苷酸重复基元,分别占总SSR的54.48%、17.31%和16.36%。人参属EST-SSR的优势类型为A/T和AT/TA,分别占54.73%和8.21%。根据人参属植物EST中的SSR设计48对引物,在合适的PCR扩增体系下,用5个三七样品的DNA为模板进行PCR扩增,引物有效扩增率85.42%,其中多态性引物占可扩增引物的70.73%。结果表明,利用人参属EST序列开发三七EST-SSR标记是可行的。     

竹类植物EST-SSRs分布特征及应用

本研究利用毛竹已有的EST序列,开发竹类植物EST-SSR标记,旨在对竹子的分子分类进行研究。通过对3087条毛竹(Phyllostachys pubescens)EST序列进行筛选,获得了408条含有SSR的毛竹EST,在所有的EST-SSR中,三核苷酸重复类型(49.75%)最多,其次是二核苷酸重复类型(43.14%)、五核苷酸重复类型(4.41%)、四核苷酸重复类型(1.72%)和六核苷酸重复类型(0.98%)。不同基序类型中,GAG/CTC基序和AG基序分别是三核苷酸重复类型和二核苷酸重复类型中含量最高的重复基序,分别占18.72%和71.02%。当SSR长度等于18bp时,所检测到的SSR数量最多,达140条。随着SSR长度的增加,所检测到的SSR数量呈下降的趋势。根据搜索出的EST序列,共设计出25对引物,对12个竹类植物进行了扩增效率、多态性及通用性检测。其中18对引物能够扩增出稳定且清晰的条带,16对引物扩增具有多态性,扩增片段长度主要集中在100～500bp,引物有效率达64%。依据扩增结果进行遗传相似性分析,12种竹类植物可分为两大类群:丛生竹类群(clump bamboos)和散生竹类群...     

铁皮石斛EST-SSR分子标记的开发

为了开发铁皮石斛EST-SSR分子标记,利用SSRIT软件对铁皮石斛近缘物种-金钗石斛的15 383条EST序列进行SSR位点查找,利用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价,之后经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初步筛选,并通过聚丙烯酰氨凝胶电泳对所筛选的引物进行有效性检测。结果表明,SSRIT软件共查找到370条SSR位点序列,共有379个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为2.46%。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占41.42%、26.91%和27.44%,其中二核苷酸重复中AG/CT(20.84%)和GA/TC(18.73%)最丰富;三核苷酸重复中TCT/AGA(4.22%)和GA/TC(3.96%)最丰富;而六核苷酸重复基元较多。EST-SSR平均长度为24 bp,平均每8.5条EST序列包含1个SSR位点。设计的106对EST-SSR引物中有50对能扩增出理想的PCR产物,引物有效扩增率为47.17%,其中有43对能够扩增出多态性条带,占可扩增引物的86%。本研究开发的43对引物为铁皮石斛遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建和功能基因研究等提供了重要的参考价值。     

香菇表达序列标签(EST)的SSR分析及EST-SSR引物的筛选

从真菌基因组计划网站(FGP)和NCBI网站数据库下载了总长度为8.1Mb的11150条香菇的EST(包括香菇的10条cDNA)序列，通过SSRhunter 1.3软件结合手工查找，从中发现2.83％即316条EST含有一共469个SSR.，平均每17.3kb出现一个EST-SSR。在所有EST-SSR中，三碱基和六碱基SSR出现最多，分别占EST-SSR总数的38.00％和20.00%，出现较多的基元为(A)n、(T)n、(GA)n、(AG)n、(TGA)n、(GAT)n和(TCTTT)n，占所有EST-SSR的35.39％。利用Oligo 6.0软件设计了51对EST-SSR引物，并选用其它物种的24对引物，对香菇菌株进行了PCR扩增。实验结果表明，设计的51对引物有39对具有明显的扩增产物，选用的其它物种的24对引物均没有清晰可见的特异性扩增产物。部分有扩增产物的EST-SSR引物具有多态性。     

大白菜表达序列标签SSR标记分析*

对大白菜（Brassica campestris L．ssppekinensis）13007个EST序列进行拼接共得到7714个片段重叠群（contig），其中10．4％（890个）非冗余EST含有SSR标记（EST-SSR），标记间平均间隔距离为3．9kb，单、双和三核苷酸重复序列大约各占1／3左右。CDS所包含的三核苷酸重复序列最多，而且AAG／CTT重复序列的含量最高。通过同源性比较分析，获得功能已知的SSR-ESTs774个，共计含有846个SSR，其中50．2％位于5＇-UTR，31．4％位于3＇-UTR，18．4％位于CDS。实验选取123个SSR座位设计引物，利用芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的高抗和高感大白菜F6代自交系材料各2份，分析EST-SSR标记多态性。结果表明，其中37个标记可进行有效扩增，但是没有表现出多态性，23个标记（18．7％）至少在1份材料中具有多态性。对这些EST-SSR标记在大白菜和其它芸薹属植物的系统发育关系分析、遗传作图和基因定位的应用进行了讨论。     

四种栎树EST-SSR信息分析

为开发栎属遗传多样性检测的SSR标记,分析了蒙古栎、无梗花栎、夏栎和欧洲栓皮栎EST-SSR的特点,结果表明蒙古栎的EST中3 209.46 bp有一个SSR,无梗花栎中每6 160.36 bp有一个SSR、夏栎中每5 883.30 bp有一个SSR,欧洲栓皮栎中每6 129.12 bp有一个SSR。蒙古栎、无梗花栎、夏栎和欧洲栓皮栎EST-SSR的平均长度分别为21.65 bp、21.1 bp、20.66 bp和20.65 bp。四种栎类中不同基元的EST-SSR的分布频率具有非常一致的特征,均是二基元、三基元和六基元的SSR分布频率最高,达20%以上。而四基元和五基元的SSR在四个种类中的分布不到0.05%。二基元的SSR中大于1%的SSR均是AG、CT、TC、GA、AT、TA基元,并且在蒙古栎、无梗花栎和夏栎中AG、CT、TC基元的分布频率最高,而在欧洲栓皮栎中是TC、GA、AG的分布频率最高;三基元的SSR中,含CAA、GAA、TCT、CTT的SSR在四种栎类中都存在。六基元的SSR中大于1%在四种栎类中出现的类型均较少,为0～4种。     

菊花EST-SSR标记开发及其对万寿菊的可转移性研究

为开发菊花EST-SSR标记并用于万春菊资源分析,研究了菊花的EST-SSR特征、标记开发及其在万寿菊上的可转移性。结果表明,菊花EST-SSR出现频率为5.35%,平均每10.64 kb存在1个SSR位点。在这些SSR位点中,共有83种重复基元,2-6核苷酸重复类型分别为10、40、14、5和14种。以14个菊花品种DNA为模板,22对菊花EST-SSR引物中14对可以扩增到清晰且稳定的PCR产物,共检出49个位点,平均每对引物可扩增出3.5条多态性片段,平均多态性信息含量(PIC)为0.751。在14对有效引物中,8对可以在待检万寿菊样品中扩增到清晰稳定的条带,可转移率为57.14%。综上所述,菊花以三核苷酸重复类型占主导,六核苷酸重复类型高于其它植物种类,菊花EST-SSR引物多态性信息含量处于较高水平。本研究可为万寿菊分子标记辅助育种奠定科学基础。     

人参EST-SSR标记的建立

从7055条人参EST序列中共搜索出791个SSR。根据引物设计标准,设计了68对EST-SSR引物。在合适的PCR反应体系下,分别以人参品种集安长脖、抚松二马牙的DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,发现有43对EST-SSR引物能扩增出产物。在9个人参品种、2个西洋参品种和2个刺五加品种中进一步对这些可扩增的引物对进行多态性检测,发现有26对引物显示多态性,占可扩增引物的60.47%,占设计引物总数的38.23%。本研究结果表明,根据人参EST建立EST-SSR标记是一种行而有效的的方法。     

紫楠转录组EST-SSR标记开发及通用性分析

紫楠(Phoebe sheareri)是商品材金丝楠木的原植物种之一,现存野生资源日益减少,为了进一步掌握其遗传多样性和遗传结构特征,大规模开发该种表达序列标签-简单重复序列(expressed sequence tag-simple sequence repeat,EST-SSR)标记迫在眉睫。本研究首次进行紫楠转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并进行引物的初步验证以及在楠属植物的通用性检测。结果显示,通过Illumina Hiseq 2500测序共获得43 781条Unigene,应用MISA软件鉴定了6 958个SSR位点,分布频率为15.89%,平均每5.31 kb出现1个SSR位点。紫楠SSR位点共包括340种重复基元,以二、三核苷酸为主,其优势重复基元分别为AG/CT(23.99%)和AAG/CCT(12.81%)。基于不同重复基元类型设计合成了94对SSR引物,以10份紫楠及同属4种楠木的基因组DNA为模板对其有效性及通用性进行初步验证,筛选出具有清晰扩增产物的引物41对,其中32对具有多态性,其平均等位基因数2.75个,观察杂合度(heterozygosity,Ho)、期望杂合度(heterozygosity,He)、多态信息含量(polymorphism information content,PIC)分别为0.369、0.563和0.541,且在同属材料中通用性较高。紫楠转录组测序获得的Unigene可作为SSR标记开发的有效来源,所获得的EST-SSR引物可为紫楠及楠属其他树种的遗传结构分析、种质资源利用及遗传图谱构建提供有效的分子标记。     

EST <Emphasis Type="Italic">versus</Emphasis> Genomic Derived Microsatellite Markers for Genotyping Wild and Cultivated Barley

Genetic variation present in wild and cultivated barley populations was investigated using two sources of microsatellite also known as simple sequence repeat (SSR) markers. EST-SSRs are derived from expressed sequences and genomic SSRs are isolated from genomic DNA. Genomic SSR markers detected a higher level of polymorphism than those derived from ESTs. Polymorphism information content was higher in genomic SSRs than EST-derived SSRs. This study showed that the EST-SSR markers developed in cultivated barley are polymorphic in wild and cultivated varieties and produced high quality markers. Ten of these functional markers were polymorphic across the accessions studied. EST markers indicated clearer separation between wild and cultivated barley than genomic SSRs. The EST-SSRs are a valuable source of new polymorphic markers and should be highly applicable to barley genetic resources, providing a direct estimate of functional biodiversity.     

Development of EST-SSR in foxtail millet (<Emphasis Type="Italic">Setaria italica</Emphasis>)

The development of EST-SSR in foxtail millet (Setaria italica) for polymorphism and transferability study was reported here. From 1213 EST sequences, 30 SSRs were obtained and primers were designed for 26 SSRs. Among them, four pairs of SSR primers amplified polymorphic products in 12 foxtail millet cultivars and one accession of Setaria viridis, a wild relative of foxtail millet, with 10 alleles detected for the four loci and 2.5 alleles per locus. In addition, ten SSR markers could be transferred to other nine Gramineae species. The putative functions of 11 ESTs containing polymorphic and transferable SSRs were also identified.     

花生ARAhPR10基因启动子序列的克隆及分析

PR10（pathogenesis-related class10protein）类蛋白与植物的抵御外来病害及系统获得性抗性（SAR）有着紧密联系,本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗黄曲霉花生品种粤油20中克隆ARAhPR10（Aspergillus flavus-resistant AhPR10）基因起始密码子ATG上游256bp类似启动子序列,并对其进行植物顺式作用元件数据库PLACE预测分析。结果表明,该类似启动子序列含有4处TATA box和2处CAAT box保守的启动子结构元件,还有6处W-box、1处BIHD1和3处GT-1motif抗逆应答元件,其中W-box常见于PR蛋白的启动子区内参与病程应答。我们初步认为本研究克隆的序列可能是ARAhPR10基因的启动子。     

中国96个荔枝种质资源的EST-SSR遗传多样性分析

根据本实验室已获得的荔枝果皮cDNA文库EST序列,通过SSRIT在线检索,从3391条EST序列中,发现305条含有SSR,占整个文库EST的8.99%。利用SSR-ESTs序列共设计100对EST-SSR引物,其中62对在荔枝上有扩增产物,50对有扩增多态性,即具有一定的通用性。接着从96份荔枝种质中选取12个品种的基因组DNA,开展核心引物筛选,共筛选出多态性较好的EST-SSR分子标记30个;这30个EST-SSR分子标记在96份资源共扩出284条带,不同引物的扩增条带在3～18条之间,平均9.47条,其中有282条为多态性带,多态率高达99.30%,每对引物的Nei＇s基因多样度范围为0.186～0.396,香农信息指数范围为0.318～0.558;此外,系统聚类分析结果表明,在相似系数0.5525处,可将96份荔枝种质资源分成了8大类群,该8大类群基本与其生态类型和植物学性状特征相符。在此基础上,还对荔枝的主栽品种和特殊种质进行鉴别,结果表明,该30个EST-SSR分子标记在不同品种间可产生较清晰可辨的多态性差异,为荔枝品种以及种质资源鉴别和鉴定的分子指纹的构建奠定了良好基础。     

苹果EST中微卫星分析

利用MISA（microsatellite）软件分析了简单重复序列（simple sequence repeats,SSRs）在苹果EST中的分布频率与密度。结果表明,在263820条EST序列中,共获得160686条SSR序列,SSRs之间的距离约为0．79kb。其中,六碱基重复丰度最大,占57．2％,而单碱基、三碱基、二碱基、四碱基和五碱基重复丰度分别为14．5％,13．1％,10．1％,4．1％和1．0％。在单碱基、二碱基、三碱基和四碱基重复模体中,丰度最大的分别是A／T,AG,AAG和AAAG,而CG在编码区内丰度很低。用CAP3软件进行冗余分析表明,在这六种类型的重复模体中,冗余与非冗余的苹果EST之间没有显著差异,表明可从现有的ESTs数据中方便地获取有效的苹果微卫星标记。     

松墨天牛幼虫cDNA文库的构建及EST分析

松墨天牛（Monlchamus alternatus Hope）是林业重大害虫。本研究运用SMART技术构建了松墨天牛幼虫cDNA文库,库容量为1.09×10^6,文库滴度为5.45×10^6 pfu/mL,重组率为97.8%,平均插入片段大小约为1 000 bp,构建的文库质量较好。随机选取1 022个克隆进行测序,获得了1 012条表达序列标签（ESTs）,序列在GenBank中登录号为JZ143720～JZ144731。EST序列经过聚类拼接得到411条非重复单一序列,其中216条序列有功能注释。在216条有功能注释的序列中,有181条（83.80%）参与＂分子功能＂,122条（56.48%）参与＂细胞成分＂,168条参与＂分子生物学过程＂（77.78%）。研究结果为克隆和分析松墨天牛新的功能基因奠定了基础。