摩杂一代水牛与广西沼泽型水牛垂体组织结构的比较研究

对广西摩杂一代水牛的脑垂体进行组织学研究,并和广西沼泽型水牛(Bubalus bubalis)的脑垂体进行比较。将两种水牛的脑垂体做成切片,采用HE染色并通过图像分析仪进行分析。结果显示摩杂一代水牛脑垂体呈长卵圆形,其神经部细胞大小和细胞密度和广西沼泽型水牛差异不显著,中间部的嫌色细胞较广西沼泽型水牛的多,而远侧部的各种细胞出现率表现出差异显著,其中嗜酸性细胞与广西沼泽型水牛差异极显著。这些结果为培育广西奶水牛提供形态学依据。     

微卫星标记分析广西水牛遗传多样性

为研究广西沼泽型水牛(Bubalus bubalis)核基因组的多态性,采用23对荧光标记微卫星引物,对随机抽取的60个广西本地水牛样本进行了PCR检测。结果表明,23对引物中,有19对可以获得特异性产物且存在多态,平均有效等位基因数为4.0189,基因座ILSTS086含有13个等位基因;各微卫星基因座的平均杂合度变化范围为0.1852~0.4722,ILSTS019基因座平均杂合度最高(0.4722),而ILSTS017平均杂合度最低(0.1852);群体基因平均多态信息含量(PIC)为0.6639,19个标记中有18个PIC大于0.5,属高度多态位点。     

世界首例性别控制水牛在广西诞生

2006年2月13日上午11时20分,一头杂交母水牛在广西南宁顺利地产下了经分离XY精子性别控制的雌性试管水牛双犊,这在世界上尚属首例。分离水牛XY精子的性别控制研究项目由广西大学动物繁殖研究所所长、博士生导师卢克焕教授主持,广西水牛研究所和广西畜禽品种改良站共同参与完成。该项目获得了国家自然科学基金、广西区人民政府主席基金和区科技厅科技攻关项目资金联合资助。这两头性别控制试管水牛犊体重均为29 kg。“姊妹花”的出生经历了复杂、严密的科学设计:首先是用流式细胞仪分离出良种摩拉水牛精液的X精子和Y精子,然后将X精子与本…     

血浆孕酮含量与广西本地母牛妊娠关系的研究

用放免法测定血浆孕酮含量,进行母牛妊娠诊断。一批103头母黄牛直检后采血测孕酮,以孕酮含量1.0—1.5,1.5—2.0,2.0～2.5ng/ml,高于2.5ng/ml为标准,诊断为妊娠的准确率分别是40.0%,57.0%,80.0%,84.4%;低于1.0ng/ml时,诊断为未妊娠的准确率为88.0%。另一批17头同期发情、输精后20天内未返情的母黄牛,于输精后20,25,30天各采血一次测孕酮作孕检,结果表明,应用此法未能取得完全一致的结果。81头母水牛孕检后采血测孕酮,以孕酮含量1.0～1.5,1.5～2.0ng/ml,高于2.0ng/ml 为标准,诊断为妊娠的准确率分别是70%,91%,100%;低于1.0ng/ml时,诊断为未妊娠的准确率是53%。     

大菱鲆主要器官的组织学观察

应用光学显微技术对大菱鲆（Scophthalmusmazimus）心脏、胃、肠、肝脏、胰脏、脾脏、肾脏的结构进行了组织学观察。结果显示，大菱鲆的心脏分为心内膜、心肌层和心外膜，其中以心肌层为最厚。胃、肠的管壁由内向外分为：黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜。胃腺内偶见含有嗜酸性颗粒的细胞。肠皱襞较高，黏膜上皮为单层柱状上皮．杯状细胞散在于柱状上皮细胞之间。肝细胞体积较大．呈多边形,肝细胞以中央静脉为中心，排列成凹凸不平的肝细胞索，相邻的肝细胞索互相吻合连接成网状。胰脏大部分附着于肠壁上，少部分埋藏在肝脏内。脾脏实质分为白髓和红髓，中央动脉数量较多。肾脏无皮质髓质之分，由肾小体和肾小管构成。     

广西沼泽型水牛γ-干扰素基因的克隆与原核表达

本研究克隆了广西沼泽型水牛γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)基因,并构建了水牛IFN-γ原核表达质粒。从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导培养13 h后,提取细胞总RNA,用水牛IFN-γ基因特异性引物通过RT-PCR扩增水牛IFN-γ成熟肽编码区cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中。RT-PCR产物电泳可见约457 bp大小目的片段。经过限制性酶切分析,测序证实克隆得到的基因序列正确。将IFN-γ成熟肽编码区基因片段切下亚克隆到表达载体pET-32a 中,构建成重组表达质粒pET-mIFN-γ。PCR、双酶切电泳和序列测定结果均证实已插入约457 bp的IFN-γ基因片段。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,水牛IFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高效的表达,融合蛋白的分子量为35 ku,表达量占菌体总蛋白的43.6%。     

水牛的血结

对水牛的血结（ｈｅｍａｌｎｏｄｅ）进行了解剖学和组织学（包括光镜、扫描电镜、透射电镜及组织化学）研究。血结为暗红色小体，圆形或椭圆形，公母及大小水牛均有，直径约５～１２ｍｍ，分散存在，有小血管与之相连。主要分布于胸、腹腔大动脉附近，纵隔及肠系膜根部，数目不等，多者可达百余个。血结的组织结构与淋巴结相似，由被膜、血窦和淋巴组织构成，其特点是窦腔及淋巴组织内有大量血细胞，未见到输入淋巴管。说明血结是位于血液循环通路上正常的淋巴器官。作者通过观察，认为血结至少有滤血、吞噬红细胞以及参与免疫反应等功能，尤其对血结的免疫功能进行了讨论，提供了有用的免疫形态学依据。血结的功能类似脾脏，其在免疫学的地位应引起人们充分的注意。     

斑马鱼性腺发育的组织学观察

在过去几十年,斑马鱼（Danio rerio）由于其发育周期短且速度快,胚胎发育透明,已经成为众多研究领域的典型模式生物。斑马鱼的性腺发育和分化非常特殊,雄性和雌性幼鱼的性腺在早期全部发育成＂类卵巢＂结构。目前,对于斑马鱼的性别分化和性腺分化机制还不清楚。本文以孵化后不同时期的斑马鱼仔鱼和幼鱼的生殖腺为材料,经石蜡切片和苏木精染色后,荧光显微镜下观察了斑马鱼仔鱼性腺从出现、分化到成熟的发育过程。结果发现：孵化后5～10日龄仔鱼腹腔两侧可以观察到没有分化的生殖腺,其中的生殖细胞明显比周围的体细胞大;孵化后14～24日龄仔鱼的生殖腺中可见由卵原细胞分裂形成的生殖包囊,其中的生殖细胞进一步分化、分裂形成体积更大、数量更多的卵母细胞;25日龄左右的仔鱼,其性腺成为在腹腔两侧对称,而且在组织结构上也较为典型的卵巢样结构。到35日龄前后可见一部分仔鱼的性腺逐步由卵巢样结构向精巢结构转变的过程。我们在2周左右的仔鱼的性腺中观察到了生殖包囊存在,这一现象还未见有前人报道。在本试验中,我们不仅清楚地观察到类似卵巢的性腺中＂卵母细胞＂逐渐凋亡消失的过程,还观察到性腺由最初的类似卵巢样结构逐渐变成典型的精巢结构的整个过程。这些研究成果将为发育生物学提供有价值的信息和第一手资料。     

水牛MyD88 cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88（mydoid differentiation factor88,MyD88）cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析。结果显示,克隆到的水牛MyD88cDNA全长为1189bp,含有1个891bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65。经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39kD的重组融合蛋白。用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达。本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础。     

水牛和黄牛种间体外受精的研究

将从屠宰母牛卵巢上采集的水牛和黄牛的卵母细胞经 2 0～ 2 4 h体外成熟培养后 ,分别用么拉水牛或奶牛精液进行种间和种内体外受精。受精卵在体外条件下继续培养到囊胚和孵化囊胚阶段。结果表明 ,用黄牛精子受精水牛卵母细胞 (黄×水 )或用水牛精子受精黄牛卵母细胞 (水×黄 )的种间体外受精均有较高的卵裂率 (分别为 4 6.5%和 68.4 % )。但其体外囊胚发育率分别只有 3.5%和 8.7% ,显著低于种内受精组(水×水组为 1 9.9% ,黄×黄组为 2 8.0 % ,P<0 .0 5)。在受精后 2 0 h对受精卵进行固定、染色 ,发现种间受精的黄×水和水×黄组 ,分别有 36.8%和 75.0 %的受精卵形成有 1个以上原核 ,且这些受精激活卵中大部分含 2个原核以上 (分别为 80 .9%和 80 .0 % ) ,说明种间受精的精子已进入到卵母细胞内受精并形成了雄性原核。     

水牛γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性分析

将原核表达的重组水牛(Bubalus bubalis)γ-干扰素成熟蛋(rGST-WBIFN-γ)以100 μg/只剂量免疫8周龄Balb/c小鼠(Mus musculus),经5次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以rHIS-WB-IFN-γ和rGST-WBIFN-γ蛋白共同作为检测抗原进行间接ELISA检测,筛选并最终得到了2株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株(分别命名为IE4和4A11),分泌抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链.Western-blotting检测显示:2株单克隆抗体与原核表达的rWBIFN-γ蛋白均能特异性结合,具有良好的免疫反应原性.     

水牛α-干扰素基因的克隆与表达及其抗病毒活性

从福安和富钟水牛(water buffalo，WB)基因组中克隆了其α-干扰素基因Fa-WBIFN-α,和Fz—WBIFN-α,，并分别与pQE30表达载体连接、测序后用IPTG诱导表达。结果表明，水牛IFN—α基因全长498个核苷酸，编码166个氨基酸的成熟蛋白，与已报道的牛α-干扰素(BoIFN—α)8个亚型氨基酸序列同源性为91．6％～94．2％，均为BoIFN—α的新亚型。SDS-PAGE和Western blot分析表明，表达产物分子量约为20kD，表达量占菌体总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在。经包涵体提取、尿素变性和复性后，重组水牛α-干扰素(rWBIFN—α)在CEF／VSV和MDBK／VSV细胞系上的活性分别为10^5U／mg和10^6U／mg。并且，rWBIFN-α对传染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus IBRV)感染有抑制作用。     

水牛输卵管上皮细胞无血清培养的研究

以广西沼泽型水牛（Bubalus bubalis）输卵管为材料，比较研究不同取材方法、有无血清及生长因子对水牛输卵管上皮细胞培养的影响。试验采用了三种不同的取材方法。原代用含血清的培养液来培养，传代用添加生长因子的无血清复杂培养液和不添加生长因子的无血清基础培养液结合梯度减量无血清培养法和直接无血清培养法来培养并进行观察。结果表明，水牛输卵管上皮细胞可以在添加生长因子的无血清复杂培养液中生长、并且最长可维持56d优于基础无血清培养的15d；刮取法获得的细胞活率为95％优于消化法的70％和剪碎法的83％；细胞冷冻复苏率为83．6％；第5代的染色体数目为48条，这说明细胞依然保持正常的生物学特性和二倍体核型。     

不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响

本研究探讨了不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响。水牛体外成熟卵进行ICSI介导转基因（ICSI—mediatedgenetransfer。ICSI．Tr）操作后,先用5ixmol／L的离子霉素（ionomycin,Ion）激活处理5min,然后分成3组,再分别用10μg／mL放线菌酮（cycloheximide,CHX）培养5h（CHX5h组）、10μg／mLCHX培养3h后再用2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）培养2h（CHX3h-DMAP2h组）或用培养液（CM）培养3h后再用2mmol／L6-DMAP培养2h（CM3h．DMAP2h组）。结果显示,CHX5h组的分裂率、早期胚胎基因表达率和囊胚发育率最高,且显著高于CM3h．DMAP2h组（66．7％比49．5％,p〈0．05;66．7％比40．0％,p〈0．01;22．2％比9．9％,p〈0．05）。ICSI18h后检查原核形成率,发现CHX5h和CHX3h．DMAP2h处理组的完整精子头百分率显著低于CM3h-DMAP2h处理组（p〈0．05）,2原核（pronucleus,PN）百分率则显著提高（42．4％比23．8％,p〈0．05;44．6％比23．8％,p〈0．01）。以上结果表明,在水牛ICSI介导转基因时,Ion联合CHX较Ion联合6-DMAP激活重构胚效果好。     

水牛及小鼠腔前卵泡分离的研究

对水牛和小鼠腔前卵泡的分离方法进行了系统探索,旨在找出一种水牛和小鼠腔前卵泡的有效分离方法。实验一分别用梳刮法、剪碎法和显微分离法分离回收水牛卵巢腔前卵泡;实验二采用梳刮法分离水牛胎牛、青年牛和成年牛腔前卵泡;实验三分别用浓度为0(CK)、0.02%、0.04%、0.08%的胶原酶消化水牛卵巢20 m in,然后采集腔前卵泡;实验四采用梳刮法、剪碎法和显微分离法分离小鼠卵巢的腔前卵泡。结果表明,梳刮法能有效地分离回收水牛和小鼠卵巢的腔前卵泡。该法分离水牛卵巢所得腔前卵泡的原始卵泡最多,次级卵泡最少,而分离小鼠卵巢所得腔前卵泡的次级卵泡最多,原始卵泡最少;水牛胎牛卵巢可分离得到较多的腔前卵泡;酶消化有助于提高剪碎法的腔前卵泡分离效率。     

供体细胞处理方法对水牛核移植效果的影响

本研究探讨了水牛供体细胞不同培养处理方法对细胞周期及其核移植效果的影响。流式细胞仪分析供体细胞周期的结果显示,水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞,在增长期、汇合长满期或经血清饥饿培养或0.1μg/mL蚜栖菌素(APD) 0.5%胎牛血清(FBS)培养处理后,G0 G1期细胞比率差异显著(P<0.05),其中以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理的G0 G1期细胞比率最高(87.89%和89.04%);而增长期的G 2 M期的细胞比率以及汇合长满期的S期细胞比率明显高于其他三组,但经血清饥饿处理后,DNA碎片明显高于其他三组(P<0.05)。当分别以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理后的水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞作供核时,重组胚的卵裂率及囊胚发育率,均显著高于血清饥饿处理或汇合长满期的同种供体细胞(成纤维细胞:70.14%vs 58.29%和55.90%,21.33%vs 10.55%和8.72%;颗粒细胞:74.35%vs 60.51%和57.61%,22.17%vs10.26%和9.78%,P<0.05),但汇合长满期或血清饥饿处理的供体细胞构建的重组胚,其卵裂率和囊胚率均没有显著差异(P>0.05)。将经APD处理后的供体细胞构建核移植胚胎,移植给受体水牛后有1头受体水牛妊娠并成功的产下后代。以上结果表明:0.1μg/mL APD 0.5?S预培养处理供体细胞,能有效的抑制细胞停留在G0/G1期,并能提高其核移植胚胎的发育率,而且已成功的获得后代。但在本培养系统中,血清饥饿处理供核细胞是没有必要的。     

水牛体细胞核移植相关影响因素的研究

主要是探讨水牛卵母细胞的体外成熟与供体的年龄和性别对其核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞,在含有5μg／mL细胞松弛素的操作液中进行去核,然后将经0．1μg／mL蚜栖菌素（Aphidicolin,APD）培养处理24h,再用0．5％胎牛血清（FBS）培养2d的水牛耳皮成纤维细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中,再经电融合形成重构胚。重构胚经5μmol／L离子霉素激活处理5min并在2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中（30μL）培养7d,观察其卵裂和胚胎发育情况。结果显示：在添加有10ng／mL上皮生长因子（EGF）成熟液中培养的受体水牛卵母细胞的融合率和重组胚卵裂率与对照组无显著差异（P〉0．05）,但其囊胚发育率明显高于对照组（18．53％vs．7．56％,P〈0．05）。来自胎儿（3个月）或成年（一头5～6岁,另一头22岁）水牛的耳皮成纤维细胞核移植后重组胚的卵裂率差异不显著（P〉0．05）,但水牛胎儿体细胞构建的重组胚囊胚率显著高于成年体细胞（22．55％vs．10．77％和8．09％,P〈0．05）。雌性水牛成纤维细胞构建的重组胚的囊胚发育率（20．23％）显著高于雄性水牛体细胞的囊胚率（10．16％,P〈0．05）。以上结果表明：（1）成熟液中添加EGF能提高受体卵母细胞核移植后的胚胎发育率;（2）水牛体细胞核移植效果受供体的个体年龄和性别的影响：胎儿成纤维细胞的核移植效果优于成年的成纤维细胞,而且以雌性的效果较好。     

宁波市本地生态足迹与可持续发展研究

生态足迹是一种评估区域可持续发展程度和人类对自然干预程度的度量指标.通过对一般生态足迹法的调整,运用本地生态足迹模型,对宁波市2002年和2005年本地生态足迹进行了计算.结果表明,宁波市人均本地生态足迹分别为3.155 3和4.344 0 hm~2,人均生态承载力分别为0.351 4和0.364 9 hm~2,人均本地生态赤字分别为2.825 3和3.999 2 hm~2;2005年宁波市生态足迹强度指数达到了12.599,这意味着宁波市在向每1 hm2土地索取本应是12.599 hm~2土地才能提供的生态服务,反映出宁波市的生产和消费需求超过了生态环境系统的承载能力,生态环境呈现逐步恶化的趋势,可持续发展状况不容乐观.     

苹果叶片不定梢诱导及起源的细胞组织学观察

本实验获得了苹果“世界一”、“北海道9号”、“千秋”等18个品种叶片的再生不定梢，研究了基因型、基本培养基、激素、暗培养条件等影响苹果叶片不定梢再生的因素，结果表明，基因型是影响叶片不定梢再生的关键因素，对不定梢起源进行细胞组织学探讨，发现苹果叶片不定梢起源多种多样，既有单细胞起源，又有多细胞起源，既有表皮细胞，又有叶肉细胞；既有维管束薄壁组织，又有叶柄基本组织。