商陆抗病毒蛋白基因转化芥菜的初步研究

以芥菜(Brassica Juncea Coss.)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的介导,将商陆抗病毒蛋白（PAP）基因导入到芥菜中。对所获得的40株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为29株;Southern blot分析结果证明PAP基因已被整合到芥菜基因组中,在大多数转基因植株中外源基因呈单挎贝,少数为双挎贝;Northern blot分析结果表明,PAP在转基因植株中正常表达。转基因植株接种病毒试验初步结果表明,转PAP基因的植株对TuMV的侵染有一定的抑制作用。     

农杆菌介导的CFL(Cucumber-FLO-LFY)基因遗传转化大岩桐

建立和优化了农杆菌(A grobacterium tumefaciens)介导的大岩桐(Sinningia speciosa)遗传转化方法,司时将CFL(Cucumber-FLO-LFY)基因转入大岩桐中,期望获得提早开花的转基因植株.采用双酶切法将CFL基因连接到质粒载体pCAMBIA13011上,得到具有CaMV35S组成型启动子的植物表达载体pCA-CFL.以大岩桐无菌苗叶片为材料,进行潮霉素(hygromycin,Hyg)浓度梯度培养,确认20mg/L hyg为筛选压.采用超声波处理、农杆菌液浸泡等多种方法进行大岩桐转基因,GUS检测结果表明,超声波处理10 s的方法转化效率最高.转化后的叶片进行诱导培养并经过2轮Hyg筛选后,获得一批Hyg抗性再生植株.进一步用PCR、斑点杂交检测发现,CFL基因已整合到大岩桐基因组中.将转基因大岩桐移栽到盆中并在长日照的环境下生长直至开花.经分析表明,超过71%的转基因大岩桐比野生型提早26～32 d开花,且大部分的转基因植株不形成侧枝而是直接在顶端成花.研究结果提示,CFL基因和LEAFY(LFY)基因在功能上是同源的.     

水稻巯基蛋白酶抑制剂基因(OCI )转化甘薯获得转基因植株

用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将水稻巯基蛋白酶抑制剂基因(OCI)导入甘薯（Ipomoea batatas)品种栗子香，获得了转基因植株。所用菌株为根癌农杆菌LBA4404，其携带的pBinh质粒上含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT Ⅱ)基因和OCI基因。将继代培养3d后的栗子香胚性悬浮细胞与LBA4404(OD600nm=0．5)共培养4d。将共培养后的胚性悬浮细胞首先在含有2mg／L2，4-D和300mg／L Carb(carbencillin)、但不含有Kan（kanamycin)的MS液体培养基中培养5d，然后在含有2mg／L2，4-D、50mg／L Kan和300mg／L Carb的MS液体培养基中进行选择培养。选择培养4周后，将直径约1mm的抗Kan细胞团转移到添加2mg／L2，A-D、50mg／L Kan和300mg／L Carb的MS固体培养基上，共转移200个细胞团，诱导得到了8个胚性愈伤组织。将这些抗Kan胚性愈伤组织转移到添加1mg／L ABA、50mg／L Kan和100mg／LCarb的MS固体培养基上，通过体细胞胚胎发生途径获得了13株再生植株。PCR和PCR-Southern检测结果表明，获得的13株再生植株中7株是转基因植株。     

Pt-mVirD2-GUS质体蛋白编码基因的合成及转化烟草的研究

将拟南芥冷调节基因AtCor15A的质体定位信号肽编码序列、丧失了核定位信号序列的根癌农杆菌VirD2基因突变序列mVirD2和GUS基因序列,拼接成pt-mVirD2-GUS嵌合基因,由CaMV 35S启动子和Tons终止子控制,并经根癌农杆菌介导,成功导入了烟草基因组.     

农杆菌介导的抑制衰老的嵌合基因转化籼稻的研究

农杆菌介导的转化法是一种天然的遗传工程,具有诸多优越性.1993年Chan等首次利用农杆菌法成功地将外源基因转入水稻.随后又有一些实验室进行了农杆菌转化水稻的研究,并获得了较高的转化频率.但大部分的实验都是采用标记基因进行的,有用基因转化的报道则较少.同时,籼稻优良品种的转化也较困难.本实验采用抑制衰老的嵌合基因进行转化,以我国生产上的优良籼稻圭630为转化受体,力求获得有应用价值的转基因植株,为生产服务.     

CHI-PAT双价基因遗传转化贵州禾来拢

以贵州禾来拢幼胚为转化受体,用农杆菌介导法将几丁质酶和抗除草剂抗性双价基因（CHI-PAT）导入来拢幼胚,筛选出抗性愈伤组织并获得抗性植株.抗性植株经GUS组织化学及PCR检测呈阳性,转基因植株对50 mg/L的Basta溶液有抗性.初步证明CHI和PAT基因已整合进了水稻基因组中.     

根癌农杆菌介导的甘蓝高效稳定的遗传转化系统的建立及对CpTI基因转化的研究

通过对影响根癌农杆菌转化的多种因素的比较和探索后，建立了一种以农杆菌介导的高效和稳定的甘蓝遗传转化系统。选择目前在生产上大量推广应用的6个优良甘蓝品种，用其无菌苗的下胚轴作为外植体，经《农杆菌LBA4404（含质粒pBin-TI-19-2)感染，在含卡那霉素50mg/L的抗性培养基上筛选，80％的外植体表现出抗性，形成愈伤组织并进一步分化成苗。每块愈伤组织最低成苗5株，最高可达22株。对部分抗性植株的总DNA进行Southern杂交，结果表明T－DNA上的CpTI基因已整合到甘蓝基因组中，外源基因的转化频率高达20％。通过抗小菜蛾实验发现，转基因植株未转基因植株有明显的抗性。     

苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因在白三叶中的表达及转基因植株的抗病性分析

以白三叶(Trifolium repens L.)的两个品种Irrigation和Huia的子叶为转化体，用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将外源的苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因转入白三叶，经过筛选、分化和再生，得到了具有卡拉霉素抗性的再生植株。对这些植株进行PCR、Southern和Northern分析，结果表明，外源目的基因已经整合到白三叶基因组中并且得到了表达。对Northern分析呈阳性的植株进行了抗病性检测，证明表达苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因的植株病症减轻，发病率、病情指数及病毒积累量都明显低于对照，有的甚至不表现症状，达到了免疫的程度。     

根癌农杆菌介导的抗除草剂转基因甘薯植株的获得

以甘薯品种栗子香的胚性悬浮细胞为受体材料, 用根癌农杆菌介导法,获得了表达bar基因的抗除草剂转基因甘薯植株。农杆菌菌株LBA4404携带含有bar基因的双元载体pCAMBIA3300。共计450个胚性细胞团用于遗传转化。在添加2 mg/L 2,4－D、100 mg/L Carb和0.5 mg/L PPT 的固体MS培养基上选择培养8周后,得到了19个PPT抗性愈伤组织。将这19个抗性愈伤组织转移到添加1 mg/L ABA、100 mg/L Carb和0.5 mg/L PPT 的固体MS 培养基上,其中的10个抗性愈伤组织共再生出103株拟转基因植株。PCR分析表明,其中的69株为转基因植株。Southern blot分析表明,bar基因稳定整合到转基因植株的基因组中。除草剂喷洒试验结果表明,转基因植株具有高度除草剂抗性。     

转基因玉米抗性愈伤再生植株的影响因素研究

再生植株的培养是玉米转基因重要环节之一.本文比较了基本培养基、愈伤组织大小、继代次数、激素添加物对转基因抗性愈伤组织分化和再生植株的影响.结果表明:以N6为基本培养基有利于抗性愈伤组织分化;抗性愈伤组织大小在2.5 ～3.5mm之间、继代2～3次的分化率最高;再生培养基中添加ABT 0.5 mg·L-和S3307 0.25 mg·L-1能促进生根壮苗.本研究为转基因玉米再生体系建立提供了依据.     

抗青枯病转群体感应猝灭基因烟草的培育

利用具有猝灭青枯菌群体感应信号分子功能的aac基因构建高效植物表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株57株。经PCR及RT-PCR检测,筛选得到30株阳性转基因再生苗,并证实了目的基因已经整合到烟草基因组中,且在转录水平上得到表达。转基因植株苗期抗青枯病试验表明,16天后转基因烟草较对照植株病情指数降低了51,相对病情指数为56.5％。     

MpCYS4基因对苹果褐斑病病原菌侵染的响应表达及其转化株系抗性鉴定

为探究半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)基因MpCYS4在苹果响应苹果褐斑病病原菌侵染过程中的功能,以苹果矮化砧木M26野生型和MpCYS4过表达株系#1、#3、#4为材料,利用实时荧光定量PCR分析苹果褐斑病病菌侵染后MpCYS4基因在苹果叶片中的表达变化;同时,对转MpCYS4基因苹果叶片的褐斑病抗性进行鉴定,并对MpCYS4融合蛋白进行体外诱导纯化和抑菌活性分析。结果表明,MpCYS4基因的表达受褐斑病侵染诱导,其过量表达提高了苹果叶片对褐斑病的抗性,且经体外纯化的MpCYS4融合蛋白能够有效抑制褐斑病病原菌孢子的萌发和菌丝生长,表现出显著的抑菌活性。本研究结果为进一步探索MPCYS4的生物学功能及其抗病作用机制奠定了基础。     

榨菜瘤状茎膨大相关基因orf451的克隆及其表达分析

为了更好地了解榨菜(Brassica juncea var.tumida)瘤状茎膨大的分子机制,以榨菜不同发育时期的瘤状茎为材料,分离到一个c DNA-AFLP差异片段,利用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了包含有该差异片段的基因的c DNA全长(命名为orf451,Gen Bank登录号:KM213220),并对其序列及编码的蛋白质进行分析。结果表明,orf451的c DNA全长1 512 bp,最大开放阅读框为1 356 bp,与编码多聚半乳糖醛酸酶/糖苷水解酶的基因有很高的相似性(90%),其编码的蛋白具备多聚半乳糖醛酸酶(果胶裂解酶)和糖苷水解酶的功能域。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对orf451的时空表达进行分析,发现在榨菜瘤状茎形成初期orf451在表皮和外皮层表达量最高,推测orf451参与了榨菜瘤状茎膨大过程中表皮与外皮层多聚糖的水解。本研究为阐明瘤状茎生长发育调控机制提供理论依据。     

人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究

利用经密码子优化的、人工合成雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin),gna基因及RbcS启动子构建了高效特异表达载体pBAC202,通过基因枪轰击小麦幼胚和幼穗,将外源gna基因导入到3个高产小麦(TriticumaestivumL.)品种中,获得42个转基因后代株系。对转基因后代植株进行了DNA点杂交、PCR及PCR-Southern验证,确认外源gna基因已成功地整合到小麦基因组中。进一步的凝集素活性检测表明,小麦叶片中表达的凝集素可使红细胞凝集,并具有正常的生物学活性。转基因植株在人工饲养条件下进行抗蚜虫(Rhopalosiphumpadi)试验,蚜口密度抑制率从19%～73%不等,部分株系抑虫效果较好。利用转基因的方式可将外源抗虫基因gna导入到小麦中,并可有效地增强小麦的抗蚜能力,为选育具抗虫特性的优质小麦提供新的途径。     

Cadmium Accumulation and Its Effects on Uptake of Micronutrients in Indian Mustard [Brassica juncea (L.) Czern.] Grown in a Loamy Sand Soil Artificially Contaminated with Cadmium

A pot experiment was conducted in a greenhouse to evaluate the effects of different levels of cadmium (Cd) on Cd accumulation and their effects on uptake of micronutrients in Indian mustard [Brassica juncea (L.) Czern.]. Cadmium accumulation in shoots and interactions among other metals [manganese (Mn), iron (Fe), copper (Cu), and zinc (Zn)] were investigated. Ten levels of Cd ranging from 0 to 200 mg kg^–1 soil were tested. The crop was grown for 60 days in a loamy sand soil with adequate basal fertilization of nitrogen (N), phosphorus (P), and potassium (K), and dry-matter yield (DMY) was recorded. The plants were analyzed for total Cd and micronutrients, and the soil was analyzed for diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)–extractable Cd. Experimental results showed that the DTPA-extractable Cd in the soil increased consistently and significantly with increase in rates of Cd application up to 200 mg Cd kg^–1 soil. Significant reduction in the DMY of Indian mustard occurred with application of 5 mg Cd kg^–1 soil and greater. The content as well as uptake of Cd by Indian mustard increased significantly over the control at all rates of its application. It increased from 5.95 μg pot^–1 in the control to 150.6 μg pot^–1 at Cd application of 200 mg kg^–1 soil. Application of Cd to soil though decreased the content of micronutrients in plants, but significant reduction occurred only for Fe at rates beyond 50 mg Cd kg^–1 soil. However, the total removal of Fe, Zn, and Cu registered a significant decline over the control at and above Cd application of 10 mg kg^–1 and that of Mn beyond 10 mg kg^–1. In loamy sand soil, a DTPA-extractable Cd level of 3.8 mg kg^–1 soil and in plant content of 28.0 μg Cd g^–1 DMY was found to be the upper threshold levels of Cd for Indian mustard. Considerable residual content in the soil suggests that once the soil is contaminated by Cd it remains available in the soil for decades, and food crops grown on these soils may be a significant source of Cd toxicity to both humans and grazing animals.     

与大白菜TuMV抗病基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记开发

分子标记辅助选择可大大加快育种进程,然而由于大白菜抗病毒病遗传规律的复杂性,目前所定位的基因和筛选的连锁标记远不能满足育种需要,为了更好地对抗病毒病白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)进行分子标记辅助选择,本研究筛选了与大白菜抗芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记.本研究在对该基因进行定位的基础上,利用回交1代(backcross1,BC1)分离群体,采用分离群体分组分析法(bulked segregation analysis,BSA)、简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)和序列特异引物(sequence specific primer,SSP)标记技术,筛选与该基因紧密连锁的分子标记.通过对13对SSP引物和16对SSR引物的分析表明,有8对引物在两亲本间表现多态性,有5对引物扩增出的标记与基因TuRBCS01紧密连锁或共分离,分别为mBr4072、Bra025493-1、Bra025493-2、Bra025467-4和Bra025467-5.筛选出与大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01紧密连锁的分子标记2个,分别为SAAS_mBr4072_240 (1.5 cM)和Bra025493-1(1.0 cM),另有3个标记与基因TuRBCS01共分离,分别为SAAS—Bra025493-2_749、SAAS_ Bra025467-4—780和SAAS—Bra025467-5_ 956.上述标记丰富了大白菜抗TuMV分子标记的数量和种类,有望用于大白菜抗病毒病分子标记辅助选择.     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和转苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)植株的获得

为了优化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的棉花(Gossypium hirsutumL.)下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿(Medicago sativa L.)抗菌肽基因(alflafa antifungul peptide,alfAFP)为目标,利用γ-葡萄糖甘酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(Hpt)的检测方法,分析了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响.优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404,当OD_(600)值为0.5～0.7的菌液浸染5～7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10～15 min.在含200 μmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h,可更有效地提高转化率.经上述条件处理的下胚轴在含50 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤组织.愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和PCR-Southern分析.发现其中12株含有外源基因alfAFP.