柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫在鸡胚培养和鸡肾细胞中的发育

采用体外脱囊的方法,将柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和堆型艾美耳球虫(E.aceroulina)的子孢子分别接种于9日龄 SPF 鸡胚的尿囊腔和鸡肾原代细胞中,置40～41℃恒温箱中培养.E.tenella 子孢子接种 SPF 鸡胚尿囊腔后,24h 后发现早期的第一代裂殖体;34h 后可观察到成熟的第一代裂殖体和裂殖     

布氏艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫在鸡肾细胞及鸡胚培养中的发育

采用体外脱囊的方法,将布氏艾美耳球虫(Eimeria brunetti)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)的子孢子分别接种于鸡肾原代细胞和9日龄鸡的尿囊腔中,置40～41℃恒温箱内培养,结果如下:①E.brunetti 子孢子接种鸡肾原代细胞后,50h 发现第一代未成熟裂殖体;76h 发现第二代成熟裂殖体;128h 发现配子体,继续培养再无进一步发育。子孢子接种鸡胚尿囊腔后,16～48h 发现第一代裂殖体;60～72h 发现第二代裂殖体;未见到第三代裂殖体;144h 发现小配子体、大配子体和未成熟卵囊,168h 发     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的细胞培养研究

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子在鸡胚成纤维细胞和鸡胚肝细胞中不能继续发育,在鸡胚小肠上皮细胞和雏鸡肾细胞中可发育到卵囊阶段。     

鸡堆型艾美耳球虫生物学方法鉴定

[目的]确定单卵囊分离获得的鸡球虫种类.[方法]采用生物学方法,测定该鸡球虫寄生部位、最短孢子化时间、潜伏期、孢子化卵囊和孢子囊大小等生物学特征.[结果]该鸡球虫主要寄生于十二指肠,卵囊呈卵圆形,囊壁光滑分为2层,囊内有1～3个折光性颗粒,未见卵囊残体;测100个孢子化卵囊大小为(13 ～22) μm×(11 ～ 16) μm,平均为16.96 μm×12.96 μm,形状指数1.31;测60个孢子囊大小为(8～ 13) μm×(5～8) μm,平均11.22 μm ×6.83 μm;最短孢子化时间为17 h,潜伏期为99 h.[结论]根据该鸡球虫的生物学特征及参考国内外文献,鉴定该鸡球虫为堆形艾美耳球虫(Eimeria acervulina).     

布氏艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫感染后鸡血清生化指标变化的研究

以15日龄公雏作为试验对象,利用 TECHNIOON RA-1000SYSTEM 血液生化分析仪,研究了鸡在人工感染 E.brunetti(41 500个卵囊/只)、E.maxima(42000个卵囊/只)和 E.acervulina(42500个卵囊/只)后3,5,7,9和11d 时其血清中葡萄糖、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶、尿酸、总蛋白、白蛋白、钙和镁的变化.结果表明:E.brunetti,E.maxima 和 E.acervulina 感染鸡后均可使其血清谷丙转氨酶活性升高,(E.     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的制备及纯化试验

自实验感染堆型艾美耳球早熟减毒株卵囊的雏鸡小肠内容物中得到裂殖子悬液,在直径1.5cm、高5cm的DEAE52层析柱中,用PH7.6Tris—Hcl、以0.5～1.5ml/分钟流速洗脱纯化,得到纯净的裂殖子,回收率为50.49％～56.2％。     

黄艾美耳球虫小配子体发育及其超微结构的研究

利用透射电镜和扫描电镜对黄艾美耳球虫小配子体的发育过程及小配子的超微结构进行了研究。小配子的发育过程可分为小配子体生长阶段和小配子分化阶段。小配子体生长阶段发生与裂殖生殖相似的核分裂，内部产生裂痕，体积增大；小配子分化阶段，其核上方出现中心粒，同时限制膜连同核、线粒体向带虫空泡中突出，进而中心粒的中央微管消失转变成基粒，二根鞭毛从基粒长出，突入带虫泡；核的致密部进入小配子而成为小配子的核。小配子分     

鸡堆型艾美耳球虫早熟株免疫效力分析及安全性评价

选择不同首免日龄(1,2,4,6日龄)、不同免疫间隔期(间隔3,5,7,9,11 d)进行一次单剂量、单剂量重复和一次超剂量接种安全试验,计算相对增质量率、卵囊减少率、抗球虫指数(ACI)及病变记分、病变记分减少率(RLS),以确定堆型艾美耳球虫疫苗虫株最小首免日龄、免疫间隔期及安全性。结果表明,于4日龄以上首免组鸡攻毒后,十二指肠平均病变记分<1、RLS≥70%、死亡率为0、相对增质量率≥80%、卵囊减少率≥75%和ACI≥180,获得了良好的免疫效果,表明该疫苗虫株的最小首免日龄为4日龄;免疫间隔7,9,11 d的免疫攻毒鸡相对增质量率在90%以上、ACI到达185以上,表明二次免疫间隔7 d即可达到免疫效果;一次单剂量、单剂量重复和一次超剂量接种安全试验均发现,鸡肠道损伤较轻,病变记分均≤1,相对增质量率达到80%以上,表明鸡球虫病弱毒活疫苗(早熟株)符合疫苗安全性要求。     

堆型艾美耳球虫感染对鸡若干血液理化指标的影响

以120只28日龄健康的罗曼蛋公雏为研究对象,研究堆型艾美耳球虫对感染鸡部分血液生理生化指标的影响.结果表明,感染后红细胞数量.血红蛋白、血钙、血钠、血镁、血糖、胆固醇、血清总蛋白的含量及血清SOD、GSH-Px和CAT的活性降低,其中红细胞数在第6、8天显著下降(P<0.05);血红蛋白在第4、8天显著下降(P<0.05);血钙在第8天显著下降(P<0.05);血镁和血清总蛋白在第8、10天显著下降(P<0.05);SOD活性在第2、4天显著降低(P<0.05).血钾略升高,但与对照组相比差异不显著(P>0.05).血清碱性磷酸酶先降低后又升高,最后恢复至对照组水平.     

鸡堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的免疫学筛选

[目的]寻找鸡球虫保护性抗原基因,为研究基因功能和研制抗鸡球虫疫苗奠定基础.[方法]将纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊于兔皮内多点注射,制备堆型艾美耳球虫抗血清,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其效价,进行免疫学筛选.利用PCR对获得的阳性克隆进行初步鉴定.[结果]间接酶联免疫吸附试验结果表明堆型艾美耳球虫抗血清检测结果呈阳性,初步筛选到的疑似阳性斑经3次复筛后获得6个阳性克隆,1～3号克隆约为1 000bp,4～6号克隆约为1 500 bp.[结论]对堆型艾美耳球虫孢子化卵囊cD-NA文库获得的阳性克隆成功进行了免疫学筛选.     

堆型艾美耳球虫纯种的分离鉴定和致病性观察

采用单卵囊分离技术,从长春市某鸡场鸡球虫混合种中获得1株纯种球虫,鉴定为堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina).鉴定指标寄生于十二指肠和小肠前段,卵囊为卵圆形、卵囊中型.测200个卵囊的大小为(13.5-21)×(11-17.5)μm,平均为17.5×14.5μm,形态指数为1.21.测200个孢子囊大小为(4.6-9.5)×(3.5-6.5)μm.有斯氏体,无内外残体.最短孢子化时间为18h,潜伏期97h.用此卵囊对50只2周龄的海兰公鸡分为一个不感染组和4个感染组,每只口服感染1万、2万、5万和10万个孢子卵囊.结果所有感染组与对照组的平均增重差异均为显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01).     

柔嫩艾美耳球虫（Eimeria ternlla）小配子发育超微结构的观察

利用透射电镜对柔嫩艾美耳球虫小配子发育的超微结构进行了观察。小配子母细胞和大配子母细胞于相邻的宿主细胞内相伴产生,系由末代裂殖子侵入后,长大变圆而形成。小配子的形成为直接分化型。首化细胞核分裂为多个,随后细胞核向周边移动,随之近核处限制膜外突,临近外限制膜下陷。中心粒在核上方形成半并发育为基粒、鞭毛中的微管和附着微管,早期形成的小配子仍与小配子母细胞的残体相连。成熟小配子与残体分离,外型呈香蕉状,外被单位膜,内有一电子结构＋分致密的细胞核,核实端侧面有一个巨大线粒体,小配子有鞭毛2根,每根鞭毛内有微管,为9＋2结构,附着微管至少6根,这些微管起始于基粒。     

巨型艾美耳球虫裂殖子的分离和纯化

[目的]为了获得纯净的巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)裂殖子.[方法]对25日龄白羽肉鸡口服接种 3×105巨型艾美耳球虫卵囊,在其感染后48～124 h取十二指肠末端到卵黄蒂后5 cm处肠段,收集裂殖子并计数,确定分离裂殖子的最佳时间;将所取肠段均分为5段,分别对裂殖子进行计数,筛选分离裂殖子的最佳肠段;通过DEAE-52纤维素柱层析对裂殖子进行纯化并分管收集,确定收集较高纯度裂殖子的最佳时间.[结果]在感染后84 h所收集的裂殖子最多;此外,从空肠中后段及空肠末端肠段中分离出较多数量的裂殖子,占总数的62％以上;通过DEAE-52纤维素柱层析获得44 mL纯度较高的裂殖子.[结论]分离巨型艾美耳球虫裂殖子的最佳时间为感染后84 h,最佳肠段为空肠后段,收集1～44 mL洗脱液能够获得纯度较高的裂殖子.     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子在鸡胚小肠上皮细胞中的发育研究

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子在鸡胚小肠上皮细胞体外培养中完成了全部的内生性发育过程     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子体外脱囊试验

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子体外脱囊条件为0.75％胰酶,5％鸡胆汁,在38—40℃水浴箱内孵育2小时,脱囊率为94％。     

鸡巨型艾美耳球虫早熟株选育及其生物学特性研究

为选育鸡巨型艾美耳球虫(E.maxima)早熟株,并对其生物学特性进行研究,采用早熟选育法对E.maxima亲本株进行连续鸡体传代以获得早熟株,再分别将鸡E.maxima亲本株和早熟株孢子化卵囊以不同剂量口服接种14日龄无特定病原(SPF)雏鸡,测定E.maxima亲本株和早熟株的潜隐期、卵囊形态大小,并分析比较其致病性强弱和繁殖力高低。结果表明,成功选育出潜隐期为113 h的鸡E.maxima早熟株,其卵囊长和宽均显著小于亲本株卵囊。在整个试验过程中,各组鸡接种E.maxima亲本株和早熟株孢子化卵囊后均无死亡现象;当鸡E.maxima亲本株和早熟株孢子化卵囊接种剂量为0.5×10~4～20.0×10~4个/羽时,等剂量下E.maxima早熟株组鸡的相对体质量增加率显著大于亲本株组;接种量在10.0×10~4～20.0×10~4个/羽时,等剂量下E.maxima早熟株组鸡的肠道病变记分显著低于亲本株组;随接种剂量的增加,E.maxima亲本株和早熟株组鸡的相对体质量增加率逐渐降低,临床症状逐渐加重。此外,相同接种剂量下,E.maxima早熟株组卵囊产量均显著低于亲本株组,前者卵囊产量是后者的60%～75%;但随接种剂量的增加,E.maxima亲本株和早熟株组单卵囊繁殖力均呈下降趋势。综上,选育的鸡E.maxima早熟株与亲本株相比,致病力减弱、繁殖能力降低,能够为球虫多价活疫苗提供E.maxima虫种,以进一步加强鸡球虫病的防治。     

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)小配子发育超微结构的观察

利用透射电镜对柔嫩艾美耳球虫小配子发育的超微结构进行了观察 小配子母细胞和大配子母细胞于相邻的宿主细胞内相伴产生 ,系由末代裂殖子侵入后 ,长大变圆而形成 小配子的形成为直接分化型 首先细胞核分裂为多个 ,随后细胞核向周边移动 ,随之近核处限制膜外突 ,临近处限制膜下陷 中心粒在核上方形成并发育为基粒、鞭毛中的微管和附着微管 ,早期形成的小配子仍与小配子母细胞的残体相连 成熟小配子与残体分离 ,外型呈香蕉状 ,外被单位膜 ,内有一电子结构十分致密的细胞核 ,核头端侧面有一个巨大线粒体 ,小配子有鞭毛 2根 ,每根鞭毛内有微管 ,为 9+2结构 ,附着微管至少 6根 ,这些微管均起始于基粒     

堆型艾美耳球虫外分泌蛋白致细胞损伤研究

[目的]研究堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)外分泌蛋白是否具有外毒素和致细胞损伤作用.[方法]将牛肾传代细胞与E.acervulina子孢子共培养2.5h,更换无血清培养液,每间隔12 h收集入侵后0～60 h的该时间点前12 h所有培养液并透析浓缩,SDS-PAGE和Western Blot检测,确定E.acervulina的外分泌蛋白,将此蛋白加培养液培养牛肾传代细胞,利用吖啶橙和碘化丙啶染色,判断细胞损伤. [结果]E.acervulina分泌约70 kD的蛋白,12～24 h分泌蛋白最多,24～36 h蛋白分泌量明显下降,36～48 h以后几乎看不到蛋白带,0～12 h和48～60 h看不到外分泌蛋白,用含该蛋白的培养液培养牛肾传代细胞,细胞膜和核膜的通透性增加,[结论]E.acervulina第一代裂殖生殖时分泌约70 kD的蛋白,该蛋白损伤细胞膜和核膜,证明该蛋白具有球虫毒素的功能.     

堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶基因的克隆与表达

克隆了堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)基因(EaLDH),并在大肠杆菌中成功表达出重组蛋白.根据GenBank中收录的EaLDH核苷酸序列设计特异性引物,以其第一代裂殖体总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增获得EaLDH基因.将EaLDH基因片段与原核表达载体pET28a(+)连接,构建重组表达质粒pET28a(+)-LDH,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.结果表明,扩增出的EaLDH基因含993 bP的开放阅读框,与GenBank中收录的EaLDH基因序列相似性为98%.诱导后,重组蛋白能够在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白相对分子质量约为4.1×104.     

堆型艾美耳球虫cSZ1基因的克隆与分析

[目的]分析堆型艾美尔球虫cSZ1基因序列,为研制球虫疫苗提供候选抗原。[方法]根据堆型艾美尔球虫基因序列,设计合成引物,RT-PCR扩增堆型艾美尔球虫长春株cSZ1基因并测序。[结果]与GenBank中发表的堆型艾美尔球虫cSZ1基因序列相比,堆型艾美尔球虫长春株cSZ1基因发生了5个核苷酸变异,两者的核苷酸序列同源性为99.47%,两者编码区的核苷酸序列同源性为99.61%。堆型艾美尔球虫长春株cSZ1基因ORF内有2个变异位点。其中,A185G变异导致了所编码氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸。[结论]cSZ1基因编码蛋白可以作为球虫疫苗的候选抗原。