一种新的杆状病毒转移载体的构建

从家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中分别克隆出其P10基因。从BmNPV P10中亚克隆得到其5′端上游片段,经PCR定位突变使之ATG区突变成一个BglⅡ酶切位点。从AcMNPVP 10中亚克隆得到基因3′端下游片段,克隆入经突变的BmNPV P10基因启动子的下游,构建成一个新的转移表达载体pBmAcPV-1,由于BmNPV和AcMNPV P10基因及两端的同源性高达90％以上,该载体可以分别与野生型BmNPV和AcMN-PV DNA进行同源重组。     

从野桑蚕体内分离的NPV与BmNPV、AcMNPV间的RAPD分析

将野外收集的野桑蚕核型多角体病毒进行空斑筛选，纯化后的病毒通过碱裂解法抽提基因组DNA，用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的基因组DNA作对照，用随机引物进行PCR扩增。结果表明，野桑蚕分离的NPV与BmNPV、AcMNPV存在较大的差异性，通过版本为1．3b的Treecomw软件分析，表明野桑蚕体内的NPV与BmNPV的同源关系较近，而与AcMNPV的同源关系较远。     

茶尺蠖核型多角体病毒SalI 1.1 k片段的克隆及gp41部分序列分析

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)是尚未完成基因组测序的一种杆状病毒.为了解其基因组的信息,从病虫中分离纯化了茶尺蠖NPV,提取基因组DNA,构建了EoNPV DNA的SalI酶切片段文库,并对阳性克隆进行测序,获得了EoNPV gp41基因的部分序列.序列同源性分析结果表明,EoNPV与LdMNPV之间gp41基因的同源性较高,而与AcMNPV及BmNPV的同源性较低.     

豆天蛾核型多角体病毒gp41同源基因的克隆和序列分析

 【目的】对豆天蛾核型多角体病毒（CbNPV）的gp41同源基因进行克隆和序列分析，为进一步研究该病毒基因组的结构打下基础。【方法】从豆天蛾幼虫尸体中分离纯化了豆天蛾核型多角体病毒，提取其基因组DNA，用shotgun法构建了DNA片段的文库，并进行了全基因组测序。对CbNPV的gp41同源基因进行序列分析。【结果】CbNPV的gp41同源基因长度为933 bp，编码310个氨基酸。氨基酸序列同源性分析结果表明，CbNPV GP41与I类NPV及II类NPV GP41的同源性分别为53%～61%和56%～73%。【结论】初步推测，CbNPV与II类NPV的亲缘关系可能更近。     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的生物信息学分析

通过对家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori,nucleopolyhedrovirus:BmNPV)ORF 75基因核苷酸序列进行生物信息学分析,BmNPVORF 75基因位于病毒基因组70 485 bp和71 264 bp之间,编码259个氨基酸残基的多肽,预测分子相对质量为30.8 kDa,等电点为7.67,分子式为C1409H2157N351O390S19;蛋白在大肠杆菌内的半衰期大于10 h;酸性氨基酸(Asp Glu)占10.5%,碱性氨基酸(Arg Lys)占10.8%;蛋白的不稳定指数为42.67,是不稳定蛋白.利用Prosite数据库扫描,查到4类9个蛋白修饰位点.通过Blast搜索氨基酸同源序列发现,BmNPVORF 75同源蛋白存在于所有测序的鳞翅目昆虫杆状病毒中,不存在于其他非鳞翅目昆虫杆状病毒中.同源序列比对结果,BmNPVORF75蛋白的氨基酸序列与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica MNPV)ORF92之间的同源性达到100%,应为相同基因.依照BmNPVORF75同源基因序列相似性,对13种昆虫杆状病毒进行进化树构建分析,其中,BmNPVORF75与薄荷灰夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(Rachiplusia ouMN-PV)ORF89基因进化距离很近,同源性较高.     

豆天蛾核型多角体病毒泛素基因的序列分析

为了对CbNPV ubiquitin基因序列进行分析,并对目前已知全基因组序列的杆状病毒的泛素氨基酸序列进行比较。从豆天蛾幼虫尸体中分离纯化豆天蛾核型多角体病毒(CbNPV),提取基因组DNA,进行基因组测序。序列分析发现一个长度为252 bp的读码框序列与泛素基因同源性很高,该基因编码83个氨基酸。氨基酸序列同源性分析结果表明,CbNPV泛素的氨基酸序列与20种杆状病毒泛素的氨基酸序列的同源性在66.3%~82.1%,并且维持泛素功能所必需的氨基酸序列,在大部分杆状病毒中也都保守存在。     

广西家蚕核型多角体病毒株gp64基因 克隆与序列分析

[目的]了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)毒株gp64基因的保守性,并掌握其具体的突变位点,为研究核型多角体病毒(NPV)种内的微进化模式提供参考依据.[方法]对广西不同桑蚕产区的19株BmNPV毒株进行gp64基因克隆与测序,分析完整开放阅读框(ORF)序列的同源性和单核苷酸多态性,并构建基于gp64基因的遗传进化树.[结果]广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列不一致,存在1590、1593和1599 nt三种类型,是由于第94~96位缺失GCG或第97~102位插入GCGCCG所致,且插入核苷酸突变仅在广西BmNPV毒株中出现.仅GXSL毒株与T3毒株的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性均达100.0%,其余18株毒株与T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%~99.2%,其推导氨基酸序列同源性在98.7%~99.6%.19株广西BmNPV毒株被分为两个亚群(cladeⅠ和cladeⅡ),其中11株独立形成cladeⅡ,7株独立形成cladeⅠ中的一个亚群;广西毒株在多个位点出现同义核苷酸突变,呈一定的规律性.[结论]广西BmNPV毒株的gp64基因具有遗传多样性,在遗传进化上较独立,插入突变显示出地域特点.     

甜菜夜蛾核多角体病毒VP39蛋白在苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒中的功能研究

【目的】构建表达甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV） VP39蛋白的vp39假型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica MNPV,AcMNPV）,明确SeMNPV VP39是否能取代AcMNPV VP39在AcMNPV中行使功能,为深入探究杆状病毒的核衣壳装配机理打下理论基础。【方法】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统在AcMNPV vp39缺失型重组bacmid （bAcvp39KO）的基础上构建携带SeMNPV vp39基因、绿色荧光蛋白基因（Enhanced green fluorescence protein,egfp）和多角体蛋白基因（Polyhedrin,polh）的重组病毒（vAcSevp39:FLAG）。利用Western blotting检测分析SeMNPV vp39在vAcSevp39:FLAG转染的草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda） IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9（Sf9）细胞中的表达情况,通过荧光显微镜观察vAcSevp39:FLAG在Sf9中的感染和扩散情况,采用病毒滴度测定并绘制病毒生长曲线检测vAcSevp39:FLAG的感染性芽生型病毒粒子产量,并以电子显微镜观察vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中的形态发生情况。【结果】Western blotting检测结果表明,SeMNPV VP39能在v AcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中获得表达;荧光显微镜观察和病毒生长曲线测定结果表明,在vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中无感染性的芽生型病毒粒子产生,与AcMNPV vp39缺失型重组病毒（v Acvp39KO）的现象一致;电子显微镜观察发现,与vAcvp39KO不同的是,在vAcSevp39:FLAG转染的细胞中虽然未产生核衣壳,但在感染细胞的核中存在大量空的透明长管状衣壳结构,表明SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣壳结构装配,但在AcMNPV中不具备装配核衣壳的能力。【结论】SeMNPV VP39在AcMNPV中虽能形成衣壳结构,但不能有效装配核衣壳,导致无芽生型病毒粒子和包埋型病毒粒子产生。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株同源重复区hr1的结构功能分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirusⅡ,SpltNPVⅡ)基因组DNA同源重复区hr1大小为1 746 bp,含有6个64 bp不完全回文序列、4个正向重复序列以及7个与病毒基因组DNA复制相关的基序。瞬时表达分析结果表明,SpltNPVⅡhr1在感染野生型家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)和苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的BmN和Sf21细胞中均具有增强早期基因ie1启动子活性的功能,增强效率分别为30、350倍;实时荧光定量PCR结果显示,hr1在BmN和Sf21细胞中具有基因组DNA复制起始原点的功能,拷贝数分别为(8.46×10~4±6.13×10~3)、(5.92×10~6±2.95×10~5)copies/μg DNA。研究证明,SpltNPVⅡhr1在异源细胞BmN和Sf21中具有复制起始原点和增强子的双功能作用。     

可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建

【目的】构建能够感染家蚕和茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒（rBmNPV）,解决EoNPV扩增困难而不易获得的难题。【方法】通过Bac-to-Bac系统构建具备BmNPV的多角体蛋白基因（polh）表达盒和EoNPV的解旋酶基因（hel）表达盒的重组家蚕核型多角体病毒。【结果】家蚕或家蚕细胞扩增的rBmNPV可以感染茶尺蠖并致病,表明rBmNPV的宿主域拓展至茶尺蠖。【结论】成功构建了能够感染茶尺蠖的rBmNPV,为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂打下基础。     

BmNPV对家蚕BmN细胞周期及周期蛋白基因表达水平的影响

【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别在感染12,24,36h后,表达量降低为0。流式细胞仪检测结果显示,在BmNPV感染后24h左右,抑制于G2/M期的BmN细胞达到68%。【结论】BmNPV感染家蚕BmN细胞后,导致CyclinB、CyclinE基因表达量降低,对CyclinA基因表达量的影响较小;同时BmNPV感染可以将BmN细胞发育抑制于G2/M期。     

棉铃虫多核衣壳型多角体病毒fp25K基因的克隆及分析

[目的]克隆棉铃虫多核衣壳型多角体病毒(HearMNPV) fp25 K基因,为深入研究杆状病毒的进化机制提供依据。[方法]通过半补齐法建立HearMNPV的质粒基因组文库,对插入片段进行鉴定和序列分析获取HearMNPV fp25 K基因。[结果]HearMNPV fp25 K基因的读码框由588个核苷酸组成,编码195个氨基酸;该基因上游具有晚期调控保守序列ATAAG,是一个晚期表达基因;HearMNPV fp25 K存在5个α-螺旋,8个β-折叠;HearMNPV与蓓带夜蛾核型多角体一致性最高,达97.0%,与舞毒蛾多核衣壳型多角体的FP’同源性最低,仅为19.3%。HearMNPV与GroupⅠNPVs、GroupⅡNPVs及GVs的fp25K同源基因间氨基酸平均相似性分别为55.6%、69.4%和29.3%,推测其与Ⅱ类NPVs的亲缘关系较近。[结论]该研究为杆状病毒分子进化、生物防治奠定了基础。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒少多角体遗传突变株的鉴定

【目的】研究病毒基因感染昆虫宿主的分子机制。【方法】从自然界分离和鉴定斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）的遗传突变株,筛选到少多角体基因突变株-SpltMNPV B型株,克隆该株的少多角体基因（fp25K）。对不同株系SpltMNPV的fp25K进行序列分析、病毒感染的细胞培养和虫体感染试验。【结果】核苷酸序列分析表明,与中国株相比,A型和C型分别发生了4个和3个核苷酸改变,但编码的氨基酸不变;B型株3′端核苷酸发生了多处缺失和一处插入,导致FP25K蛋白C端21个氨基酸改变。病毒感染的细胞培养试验表明,fp25K基因突变导致多角体明显减少的表型。虫体试验表明,感染fp25K突变的SpltMNPV B型株的宿主液化减弱。【结论】SpltMNPV B型株是一株自然的少多角体遗传突变株,该突变株可用于更深入地解析少多角体表型成因、病毒感染后虫尸降解和液化作用的分子机制。     

AcMNPV LEF-10第21位突变对其活性的影响

[目的]对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子LEF-10的第21位保守氨基酸残基进行饱和点突变,研究该位点突变对AcMNPV活性的影响,为进一步研究LEF-10朊病毒特性及其在病毒复制中的作用奠定基础.[方法]同源序列比对发现,LEF-10第21位亮氨酸残基高度保守.对pTriEx质粒载体上LEF-...     

核型多角体病毒p74基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

 【目的】利用核型多角体病毒（NPV）的p74基因与苏云金芽胞杆菌（Bt）的cry1Ac基因构建融合基因cry1Ac-p74,构建具有广谱杀虫作用的工程菌。【方法】从Bt4.0718菌株中克隆cry1Ac基因及其终止子cry1Act,从苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）中克隆p74基因,以pMD-T作为大肠杆菌亚克隆载体,分别构建含有目的基因片段的T载体pT1Ac、pTp74、pT1Act以及中间载体pT1Act、pTp74Act,获得携带有目的融合基因cry1Ac-p74的表达载体pH1Acp74;该表达载体电转化至Bt无晶体突变株XBU001,得到目的重组菌株XBU-H1Acp74。【结果】XBU-H1Acp74可表达130 kD的Cry1Ac蛋白和50 kD的P74蛋白,生测显示P74蛋白可以协同Cry1Ac的杀虫效果。【结论】本研究成功构建了cry1Ac基因与p74基因融合的Bt工程菌,为进一步研究和构建新型生物杀虫剂的工程菌株,研制出高效、广谱、安全的杀虫剂提供了新的技术途径。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒安徽和县株系细胞凋亡抑制相关基因的克隆与遗传变异

为分析核型多角体病毒(NPV)分离株内细胞凋亡抑制相关基因的多态性,从安徽和县采集感染病毒的斜纹夜蛾病虫,分离出斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,Splt NPV)15个活体克隆株系,研究其细胞凋亡抑制基因(IAP)和P49基因多态性。发现15个Splt NPV安徽和县克隆株系中的IAP基因序列均无差异,且与已报道的Splt NPV中国G2株的同源性达100%;Splt NPV各克隆株系中的P49基因序列也无差异,且与Splt NPV中国G2株的P49基因同源性达99%。表明Splt NPV安徽和县株系IAP和P49基因均较为保守,没有表现出遗传变异。     

PrGV多角体膜蛋白（PEP）的分析

【目的】对菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris rapae Granulovirus,PrGV)多角体膜蛋白(polyhedron envelope protein,PEP)进行研究,为揭示PEP的功能及其在病毒生命过程中的作用提供参考。【方法】以PrGV PEP为对象,通过序列分析、原核表达、抗体制备、Western blotting、胶体金免疫定位、实时荧光定量PCR等方法初步确认该基因定位和表达时相。【结果】PrGV PEP与其他鳞翅目昆虫颗粒体病毒的PEP同源性达到50%左右,但未在核型多角体病毒(Nucleo polyhedro virus,NPV)中发现同源序列。定量PCR分析表明,菜青虫感染PrGV后24h可检测到PEP的存在,随后该基因的表达水平逐渐升高,并在72h达到峰值。通过Western blotting可以在感染PrGV的菜青虫体内检测到大小分别为23ku和15ku的清晰条带,说明制备的多克隆抗体具有较好的特异性。免疫金标记将PEP定位于椭圆型的颗粒体,证明PEP是GV包涵体的重要组成部分。【结论】PrGV PEP在颗粒体病毒中较为保守,可能是PrGV晚期表达的重要基因,参与病毒侵染后期颗粒体结构的形成。     

同安钮夜蛾核型多角体病毒pst I-G片段克隆及序列分析

 【目的】测定同安钮夜蛾核型多角体病毒（OpdiNPV）pst I-G 片断的序列,了解OpdiNPV的遗传结构和与其它昆虫病毒的进化关系。【方法】用pstⅠ酶切病毒基因组,电泳分离并回收pst I-G片段,连接到PUC18,转化入E.coli DH 5α,挑取阳性菌落测序。【结果】该片段长度为5 056 bp,有4个ORF,分别编码ODV-E66的C末端（EU 623602）,P87/VP80的C末端（EU 732665）,ODV-Ec43（EU617337）和Ac108（EU 732666）。ac108基因和odv-ec43起始密码子上游都有1个晚期启动子结构域TAAG,odv-ec43 基因起始密码子上游有2个早期转录起始元件CAGT;由odv-ec43推导的蛋白有2个跨膜螺旋、3个N-糖基化位点、1个N端酰基化位点、7个PKC磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和4个CKⅡ磷酸化位点;p87/vp80基因终止密码子下游有polyA信号。【结论】氨基酸序列同源分析和相似性分析显示Ac108、ODV-E66和 P87/VP80与其它昆虫病毒差异较大,ODV-Ec43的保守性较高。     

家蚕核型多角体病毒ie-2基因dsRNA表达载体的构建

为了研究ie-2基因的dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果,根据NCBI公布的BmNPV(T3株)基因组序列,克隆了BmNPV极早期表达因子ie-2.将该基因用亚克隆的方法导入到L4440载体中构建L4440-ie-2,并成功转入大肠杆菌HT115(DE3).IPTG诱导可以成功表达相应的dsRNA.     

家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP25转录分析及其免疫响应

[目的]分析家蚕丝氨酸蛋白酶(SP)基因序列BmSP25及转录情况,明确其表达规律对防御家蚕核型多角体病毒(BmNPV)入侵的免疫应答机制,为揭示BmSPs在家蚕免疫应答方面的功能作用提供理论依据.[方法]克隆BmSP25基因序列,对该基因编码蛋白的氨基酸序列、分子量、结构域等进行生物信息学分析;利用GeneDoc和MEGA 5.0对BmSP25氨基酸序列进行多序列比对及系统发育进化树分析,采用半定量RT-PCR对家蚕不同组织和发育时期的BmSP25基因转录情况进行分析,并以实时荧光定量PCR检测BmSP25基因在BmNPV感染家蚕中肠组织中的转录水平.[结果]BmSP25基因的ORF全长885 bp,编码294个氨基酸,其中第1~17位氨基酸为信号肽,去信号肽的分子量为29.1 kD,理论等电点为7.8.BmSP25蛋白由4个α螺旋、15个β折叠和一些无规则卷曲构成;其氨基酸序列同源性比对分析发现,BmSP25(BGIBMGA008514-PA)与蓓带夜蛾SP序列(GenBank登录号ADM35105)的同源性最高,为62.1%.BmSP25基因在家蚕中肠组织中特异表达,且在整个幼虫时期呈持续性表达.BmSP25基因在家蚕感染BmNPV后发生明显变化,至感染6 h时呈下调趋势,而在感染3、12和24 h时均呈明显上调表达.[结论]BmSP25在防御BmNPV入侵家蚕的免疫应答过程中发挥重要作用.鉴于昆虫SP具有高度保守的底物特异性位点,因此可利用底物类似物、基因定点突变等方式来预防农林害虫.