猪细小病毒N株弱毒苗的免疫效果观察

经调查，广西猪群普遍存在猪细小病毒感染［１］。为了有效防制该病，本研究室已研制出能预防猪细小病毒感染的弱毒疫苗（简称ＰＰＶ－Ｎ株弱毒苗）。该弱毒苗用于预防猪细小病毒引起的繁殖失败，具有良好的免疫原性和安全性［２］。我们用四批ＰＰＶ－Ｎ株弱毒苗对广西多个流行该病的猪场的后备母猪进行免疫，取得了良好的效果，现将结果报告如下。１　材料和方法１．１　ＰＰＶ－Ｎ株弱毒苗本实验室研制，种毒按蒋玉雯等［２］的方法进行培养。１．２　试验动物５００克左右健康青年豚鼠，并经ＰＰＶ－ＨＩ检测为阴性。１．３　猪细小病毒…     

马传染性贫血病病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ　 ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ,这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组,ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接,获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒,将其命名为ｐ８．０。将此８．０Ｋｂ ＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整 ＥＩＡＶ ＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中,获得一含有 ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒,将其命名为ｐ８．２,经核苷酸序列分析,证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。用ｐ８．２转染驴白细胞,将其作为种毒进行传代,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶,说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后,第４天出现病变,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子,进一步证明ｐ８．２具有感染性,我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆,为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。     

电镜技术检验犬四联弱毒苗种子毒及品的外源病毒

我们用电子显微镜（电镜）技术，检验犬四联弱毒疫苗种子毒及其成品疫苗中的外源毒。经对每批种子毒细胞培养物及间隔一定批次成品疫苗抽样检查，其中一批种子毒细胞培养物中发现了呼肠病毒污染，得到及时有效的处理。同时证明应用电镜技术检验外源病毒确是一种快速而有效的方法。     

猪细小病毒生物学特性研究

应用ＰＫ－１５传代细胞复制猪细小病毒（ＰＰＶ）参考株ＮＡＤＬ－２和云南分离株ＫＭ，研究得出细胞培养物半数细胞感染量分别为１０＾－７．９／ｍｌ和１０＾－６．８／ｍｌ经ＣｓＣｌ密度梯度离心，两种病毒颗粒其浮力密度值分别为１．３３ｇ／ｃｍ＾３和１．３９／ｃｍ，电镜观察病毒粒子呈圆形，直径约２０ｎｍ。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析，表明纯化的ＰＰＶ细胞培养毒，主要含两种蛋白成分，分子量     

鸡马立克氏病Ⅰ型弱毒株的选育

本研究利用从国外引进的鸡马立克氏病Ⅰ型弱毒疫苗株，采取回归无特定病原（ＳＰＦ）雏鸡和在细胞培养物上交替接种的方法，连续传代５次后，进行免疫效力试验的结果表明，本研究选育的ＭＤＶ－Ｇ１毒株含１０，０００和２，０００独斑形成单位（ＰＦＵ）／只鸡剂量试验组对ＭＤ的保护率均达１００％；未经选育的进口ＭＤＩ型弱毒商品疫苗２，０００ＰＦＵ／只鸡剂量试验组，对ＭＤ的保护率为８６．７％；而常规使用的ＨＶＴ商品疫苗     

抗牛暂时热(或牛流行热)细胞培养疫苗

用919株牛暂时热病毒制造细胞培养疫苗。Tzipori(1974)曾将其他牛暂时热BEF病毒株适应于Vero细胞系,并在啮齿动物进行传代,结果传代毒对牛的抗原性不如919株好。919株弱毒是将病牛血毒直接接种Veto细胞,因而避免了病毒抗原性发生改变。将919株弱毒经静脉接种犊牛所诱发的中和抗体应答和犊牛被接种417WBC株强毒后发     

狂犬病 犬肠炎 犬瘟热 犬腺病毒病犬副流感五联弱毒冻干疫苗的研究

从国外引进的犬瘟热病毒（ＣＤＶ）、犬细小病毒（ＣＰＶ）、犬腺病毒－２型（ＣＡＶ２）和犬副流感病毒病毒（ＣＰＩＶ）四联弱毒样品中，分离筛选出增殖性良好的ＣＰＶ０ＸＮ１，ＣＡＶ２－ＸＮ３和ＣＰＩＶ－ＸＮ４株。另外还通过离体异种细胞交叉传代，获得的ＣＤＶ－ＸＮ１１１２弱毒株；从狂犬病毒株疫苗样品中筛选出ＥＲＡ８３６株。经试验证明这５株病毒在５代以内可作为制苗用种毒。采用静置和旋转培养法高滴度扩增这５株弱     

牛病毒性腹泻／粘膜病O系弱毒冻干苗的试验生产和检验报告

１９９２￣１９９４年共试生产牛病毒性腹泻／粘膜病（ＢＶＤ／ＭＤ）Ｏ系细胞培养弱毒冻干苗６０万头份，通过实验室内安全检验、效力检验、无菌检验、水份测定、真空度检验、物理性状检验及在玉树、称多和泽库三个疫病发生严重的县试用，证明《ＢＶＤ／ＭＤＯ系细胞培养弱毒冻干苗制造与检验试行办法》可行，并为制定该苗的制造与检验规程提供了依据。     

猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组的遗传变异分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计了9对引物，用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒疫苗株细胞培养物中扩增得到了覆盖猪瘟病毒基因组全长的9个cDNA片段，将所得cDNA片段分别克隆至pMD18-T载体中，经测序和拼接后，获得了猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全长12310个碱基，其5’非编码区（5＇-NCR）和3＇-NCR分别由373和239个碱基组成，在3’末端有富含T的碱基插入，其间为1个大的开放阅读框架，编码3898个氨基酸残基的多聚蛋白，与国内外已发表的另外7个猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列相比，核苷酸同源性为98．7％～99．9％，氨基酸同源性为98．6％～99．9％。基因组全序列比较显示，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组在遗传上相当稳定。     

国内唯一的鹅胚化疫苗鹅胚化小鹅瘟活疫苗

鹅胚化小鹅瘟活疫苗，由扬州大学兽医学院首创研制．经农业部兽药审评委员会审查通过，于1996年8月9日被批准为国家新兽药，[证号：（96）新兽药证字第33号1，2006年1月由扬州大学控股的扬州威克生物工程有限公司重新申请该产品，并获兽药生产批准文号：小鹅瘟活疫苗（SYG26-35株）生产批准文号为兽药生字（2006）101042113；小鹅瘟活疫苗（SYG41-50株）生产批准文号为兽药生字（2006）101042050。     

猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定

从临床表现为仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）淋巴组织病料，经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪圆环病毒2型（PCV2）感染，采用无污染的猪肾细胞系（PK15）分离培养，并连续传代培育成一株细胞培养适应毒，命名为PCV2／LG株。分离毒株经细胞培养，于第25代后毒价显著升高，于第35代毒价可达10^5.6TCID 50/mL。采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）、免疫电镜技术、分子克隆及核酸序列分析等鉴定表明，分离株感染细胞后病毒抗原主要分布在细胞核及细胞质中；病毒感染的阳性细胞呈散在分布，阳性细胞数可达50％以上；免疫电镜观察到与PCV2特异抗体结合形成的病毒免疫复合物呈实心小颗粒样粒子团，病毒粒子直径约为17nm；病毒抗原基因组由1768个核苷酸组成，与GenBank登录的8个PCV2基因组序列同源性达96．2％以上。用2mL的病毒细胞培养物（10^5.6TCID 50/mL）接种30日龄PCV2抗体阴性仔猪3头，可引起典型PMWS临床症状。本研究为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、诊断及分子生物学等研究奠定了基础。     

外源病毒检验用抗鸭瘟病毒特异性阳性血清的制备与检定

为制备鸭瘟种毒和鸭瘟活疫苗检验用抗鸭瘟病毒特异性阳性血清,对6个月龄左右的山羊进行五次免疫。最后一次免疫后2周采血并分离血清,血清经混合、分装、冷冻真空干燥后,对其进行了无菌检验、外源病毒检验、剩余水分测定、中和效价测定、均匀性检验。结果表明,本研究制备的抗鸭瘟病毒阳性血清特异性良好,无菌检验、外源病毒检验和剩余水分测定均符合《中华人民共和国兽药典》(2010年版三部)规定;血清中和效价大于1∶100,均匀性良好,可满足兽药典标准中鸭瘟种毒和鸭瘟活疫苗的鉴别检验和外源病毒检验。     

农业部发布猪胃肠炎等三联活疫苗外源病毒检验方法

正(第2362号公告)最近,农业部根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定,组织修订了猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株)外源病毒检验方法(第     

猪流行性腹泻弱毒株的培育

用ＰＥＤＶＣＶ７７７株强毒适应Ｖｅｒｏ细胞系并传至１４７代。以ＰＥＤＶ沪株做效检用强毒。传代毒８３代之后适应了仔猪肾原代细胞。自９０代起进行了５次克隆纯化,克隆是在２次群斑（由５～７个单斑组成）的基础上,再进行３次单斑挑选（均是１ｍｍ以内小空斑）。以８３７斑５株继续传代并做系列试验。传代毒的毒价为１０７．０～１０７．５ＴＣＩＤ５０／０３ｍｌ。免疫接种途径为后海穴位。克隆后５代（总代次１０４代）～２５代的５批次主动免疫试验的总保护率为９５９２％（４７／４９）,对照组８８８％（１６／１８）发病。克隆后１７代～４０代的８批次被动免疫试验的总保护率为９６２％（７６／７９）,对照组１００％（１０／１０）发病。以克隆后２５代（总代次１２５代）进行稳定性试验,经６代次返祖传代毒力未返强,仍是稳定的,已符合弱毒株的标准。在与ＴＧＥ弱毒株组合制备的二联弱毒苗的初步田间试验中取得良好效果。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定及疫苗研制

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定及疫苗研制杨润德高轩李潭清（河北农业大学动物科技学院，保定０７１０００）路广济（河北省畜牧兽医站）材料与方法一、材料１．标准毒株Ｍ４１株，购自中国兽药监察所。２．抗血清兔抗Ｍ４１阳性血清及ＳＰＦ鸡血清由江苏农学院提供...     

牛传染性鼻气管炎弱毒与牛病毒性腹泻弱毒抗原免疫干扰的研究

本试验使用3~6月龄健康易感牛9头(牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体均阴性),共分3组,每组3头犊牛。第1组首免肌肉注射IBRV-LNM弱毒疫苗株种毒,接种1周后,每头牛接种BVDV-SM弱毒疫苗株;第2组只接种BVDV-SM弱毒疫苗株种毒,接种时间同第1组;第3组为对照组,接种MDBK细胞培养液。接种BVDV-SM疫苗毒后每周采血至疫苗毒接种后28 d,测定接种后BVDV抗体效价,并采用BVDV-JL检验用强毒进行攻毒试验。结果表明,第1组与第2组试验动物血清中牛病毒性腹泻病毒抗体水平无明显差异,能够抵抗BVDV-JL强毒攻击达到免疫保护的效果,说明牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-LNM弱毒疫苗株接种后在牛体内对牛病毒性腹泻病毒BVDV-SM疫苗毒不产生免疫干扰作用。     

产蛋下降综合征病毒单克隆抗体的制备

以粗提的ＥＤＳ－７６病毒（ＮＥ－４株）作为抗原，按常规方法免疫ＢＡＬＢ／ｃ鼠，最后一次免疫后第３天取脾细胞与ＳＰ２／０细胞进行融合，采用间接ＥＬＩＳＡ和ＨＩ进行双重筛选，共检出２５个阳性孔，阳性率为１４．８８％。对其中的１１个阳性值较高的孔进行３次克隆，最后获得的１１株杂交瘤细胞，经长期体外培养和冻存后复苏仍能稳定地分泌抗体；ＥＬＩＳＡ阻断试验和与其他病毒的交叉试验证明，其分泌的抗体具有高度特异性。经鉴定，１１株ＭｃＡｂ均为ＩｇＧ，均无免疫沉淀特性，腹水和细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ效价分别为１：３２００～１：５１２００和１：１２８～１：２０４８。杂交瘤细胞的染色体数目为８０～１１２，平均９２。尤为重要的是，１１株杂交瘤细胞中有４株分泌抗ＥＤＳ－７６病毒血凝素决定簇的中和单抗，细胞培养上清和腹水的ＨＩ价分别为２１０～２￣（１２）和２￣（２２）～２￣（２４），腹水的中和效价为１：１２８０～１：５１２０。     

伪狂犬病弱毒疫苗与野毒株PCR鉴别诊断方法的建立

目前，在国内用于预防猪伪狂犬病的疫苗主要是基因缺失的弱毒（Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１）为了有效地地区弱毒免疫猪和野毒感染猪，本实验分别建立了一种通用和一种鉴别ＰＣＲ诊断方法，根据已发表的伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）ｇＢ，ｇＥ基因的序列，设计并合成了两对引物：ＰＢ１／ＰＢ２和ＰＥ１／ＰＥ２，以疫苗株Ｂａｒｔｈａｋ－６１及野毒株Ｓ，Ｓｕ，Ｆ，Ｌ，Ｙ及闽Ａ（Ｍｉｎ－Ａ）ＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，结果显示用引物Ｐ     

对新城疫CS2株与4株疫苗毒株有关性能的比较

对鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）中等毒力毒株ＣＳ２株、ＮＤⅠ系、Ｒｏｋｉｎ、Ｋｏｍｅｒｏｖ和低毒力ＬａＳｏｔａ株病毒的脑内致病指数（ＩＣＰＩ）、鸡胚的半数感染量（ＥＩＤ５０）等指标进行了测定,结果是ＩＣＰＩ分别为１．２７～１．５２、１．６６～１．７０、１．４６、１．４３和０．２９～０．５;ＥＩＤ５０分别为１０＾７．５、１０＾７．５≥１０＾８．５、１０＾＾７．９和≥１０＾８．５／０．１ｍｌ。用１０倍剂量的ＣＳ２株病毒注射１月龄和１．５月龄ＳＰＥ雏鸡,均安全无不良反应,测定ＣＳ２株病毒保存期,结果在－２０℃保存６年的鸡胚２代（Ｅ２）、鸡胚６代（Ｅ６）、鸡胚１０代（Ｅ１０）毒的ＥＩＤ５０均≥１０＾７．５／０．１ｍｌ。ＮＤＣＳ２株病毒的各项指标均在中等毒力范围内,对鸡胚的半数感染量仍保持原毒（Ⅰ系）的特性,ＩＣＰＩ比原毒有所下     

用免疫荧光技术检测细胞培养物中兔出血症病毒

用本所实验室制备的兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）高免血清．按常规方法提纯出抗体（IgG），用异硫氰酸荧光素（FITC）标记IgG。在细胞培养时，培养瓶中放入玻片，当细胞长成单层时，按常规方法接种病毒液，培养24、48、96、120h时取出玻片，用荧光抗体染色，在荧光显微镜下观察不同代次的细胞毒。经观察：兔肾上皮细胞（RK）毒培养到36～48h、羊睾丸细胞（ST）毒培养到72～96h时可观察到特异性荧光，随着培养时间的延长，荧光亮度增强，胞浆内充满特异性荧光。用肝组织强毒病料触片，呈特异性荧光，对照细胞培养48h无荧光出现。证实了两株细胞培养物中有大量的兔出血症病毒存在，从而成功的分离培养出了兔出血症病毒细胞毒。