大菱鲆出血性败血症病原菌的分离与鉴定

从全身呈弥漫性出血的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus肝脏、腹水和肾脏中分离到3株菌落形态相同的优势菌,取菌株L一59231通过注射（菌液浓度分别为4×10^8、5×10^7cfu／mL,剂量0．1mL／尾）、灌喂（4×10^6cfu／mL,0．5mL/尾）和创伤浸泡（4．7×10^5cfu／mL）三种途径对大菱鲆进行人工感染试验。结果表明：以上三种途径均可造成大菱鲆的发病,灌喂感染和创伤浸泡对试验鱼的感染率为100％和57．1％,未发现死亡;注射感染的死亡率分别为100％和71．4％。药敏试验表明,庆大霉索、四环索、氯霉素、红霉素、链霉素等对L-59231菌株有较强的抑制作用。该菌呈短杆状,革兰氏染色阴性,氧化酶阳性,接触酶阴性,V—P试验阴性,硝酸盐还原反应阳性。根据《常见细菌系统鉴定手册》所描述的弧菌属的生理生化特性,综合形态观察、生理生化特征、16SrRNA基因序列等试验结果,可将L-59231菌株鉴定为创伤弧菌。     

养殖大菱鲆出血性败血症病原菌致病性的研究及鉴定

从全身弥漫性出血合并腹水的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus的腹水、肝脏和肾脏中分离到3株菌落形态相同的优势菌,编号为L-49231、L-59231、L-59232。选用L-49231菌,通过注射、浸泡和灌喂3种途径分别对两种规格(全长(12±2)cm,体重(30±2)g;全长(18±2)cm,体重(125±5)g)的养殖大菱鲆进行人工感染试验,结果证实:此菌可经上述3种途径造成该病的发生,注射和浸泡方式的感染率均为100%,死亡率分别为100%和66.7%;灌喂方式未见死亡,感染率为85.7%。该菌经革兰氏染色为阴性,杆状,大小为2~3μm×1~1.2μm,周生鞭毛,兼性厌氧,接触酶为阳性,氧化酶为阴性,V.P试验为阴性。根据《常见细菌系统鉴定手册》所描述的爱德华氏菌属的生理生化特性,菌株L-49231为迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda。     

长丝鲈“突眼病”病原菌的分离鉴定及药敏试验

从患“突眼病冶长丝鲈Osphronemas goramy肾脏中分离到1株优势菌CSL1,分别以腹腔注射、划伤浸泡和直接浸泡3种方式进行人工回归感染试验。结果表明：CSL1菌株能感染长丝鲈,且毒力较强,腹腔注射0·2 mL菌液(菌浓度为1×108 cfu/mL)可导致受试长丝鲈66·7%死亡,划伤浸泡感染(菌浓度为1×108 cfu/mL)死亡率达100%,直接浸泡感染(菌浓度为1×108 cfu/mL)无死亡,被感染长丝鲈出现与自然感染相同的症状;对菌株CSL1进行形态特征观察和主要理化特性分析,初步鉴定为豚鼠气单胞菌Aero：monas caviae;进一步选用16S rRNA对该菌进行分子鉴定,将序列结果进行Blast分析并构建进化树,结果显示,16S rRNA基因与GenBank上登录的豚鼠气单胞菌的相应序列具有很高的同源性,进化树聚为一支;综合生理生化与分子鉴定结果,判定所分离的菌株为豚鼠气单胞菌;药敏试验显示,该菌株对左氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、吡哌酸8种药物高度敏感,对阿齐霉素、新霉素和强力霉素3种药物中度敏感,对新生霉素、萘啶酸、氨卞青霉素、青霉素、阿莫西林、甲氧卞啶、链霉素、复方新诺明8种药物具有耐药性。研究表明,长丝鲈“突眼病冶的病原菌为豚鼠气单胞菌,其药敏结果可为防治该病提供用药参考,庆大霉素是治疗由豚鼠气单胞菌引起的各种养殖鱼类相关疾病的普适药物。     

草鱼铜绿假单胞菌的鉴定及药物敏感性分析

从患病草鱼C tenopharyngodon idella体表病灶上分离到一株优势菌,经分离纯化培养制成细菌悬液,分别以腹腔注射和浸泡两种方式感染草鱼。结果表明：该菌株能感染草鱼,且具较强毒力,腹腔注射0.2mL该菌液（3×109cfu/mL）,可导致受试草鱼100%死亡;创伤浸泡感染（3×108cfu/mL）,死亡率也达100%,受感染鱼出现与自然感染相似的类似赤皮病症状。对该病菌进行形态特征观察和主要理化特性分析,初步鉴定为铜绿假单胞菌Pseudom onas aeruginosa。进一步对该菌进行分子鉴定,共选用16S rRNA、RNA聚合酶β亚单位（rpoB）和促旋酶亚单位蛋白（gyrB）3个基因进行鉴定分析。序列克隆与BLAST分析结果显示,这3个基因均与GenBank上登录的铜绿假单胞菌的相应序列具有很高的同源性,16S rRNA、rpoB和gyrB基因与已知铜绿假单胞菌相应序列的同源性分别在99%、98%和93%以上。综合生理生化与分子鉴定结果,可判定所分离的菌株为铜绿假单胞菌。药敏试验结果显示：该菌对阿米卡星、菌必治、氟哌酸和妥布霉素等11种药物高度敏感,对链霉素和庆大霉素中度敏感,对罗红霉素、红霉素、四环素、苯唑青霉素、新霉素和头孢氨苄等16种药物具有耐药性。     

大菱鲆造血器官肿大病的病原分离、鉴定及药物敏感性

从患造血器官肿大病大菱鲆(Scophthalmus maximus)肾脏中分离到菌株NY79,对该菌株形态特征、生理生化特性和16S r RNA等综合分析,鉴定NY79为迟缓爱德华氏菌。NY79菌株对健康大菱鲆进行人工感染的试验发现,感染发病症状与自然发病症状一致,每条鱼的LD50为2.4×104 cfu,表明迟缓爱德华氏菌为大菱鲆造血器官肿大病的病原。药敏试验发现,NY79对阿莫西林等17种药物敏感,对红霉素等4种药物具耐受性。     

迟钝爱德华氏菌外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性

构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。     

鸡抗迟缓爱德华氏菌卵黄抗体的应用研究

从全身出血合并腹水的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus体内分离出1株细菌,经感染试验证实其病原性,并鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda。采用该菌制成全菌油乳性灭活疫苗,分4次给蛋鸡进行免疫注射,第2次加强免疫后开始收集鸡蛋,制备卵黄抗体(IgY)和其水溶性组分(W SF),并用试管凝集法测定其效价。取效价达到1∶64的鸡蛋提取卵黄抗体,分别采用口服和腹腔注射两种方式给大菱鲆进行免疫:配成含W SF 1 mL/g的饵料,给鱼连续投喂15 d;用含蛋白含量0.19 mg/mL的纯化IgY,于第1、3、14 d对大菱鲆进行腹腔注射,剂量为0.1 mL尾/。免疫后分别用注射和划伤浸泡两种方法攻毒。结果表明,口服特异性卵黄抗体对大菱鲆的免疫保护率分别为83.3%和100%,而注射免疫没有保护作用。     

养殖大菱鲆红斑溃疡病病原菌的生物学特性研究

为研究养殖大菱鲆Scophthalmus maximus红斑溃疡病病原菌的生物学特性,从辽宁葫芦岛地区养殖大菱鲆患病鱼的溃疡灶、肝脏、肾脏和脾脏中均分离到一株优势菌,命名为HLD01,该菌株呈乳白色,圆形,直径为(0.6±0.1)mm,表面湿润、光滑;用腹腔注射法和划伤浸泡法进行人工感染试验,这两种方法感染大菱鲆的半致死剂量分别为8.4×10~7、6.3×10~4CFU/mL,结果显示,人工感染患病大菱鲆体表出现与自然发病大菱鲆相同的溃疡灶及其他病症,表明菌株HLD01对大菱鲆有较强的致病力,可以引起养殖大菱鲆发生红斑溃疡病;生理生化鉴定结果显示,该菌与杀鲑气单胞菌无色亚种Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes相似度最高;基于16S rDNA序列构建的系统进化树结果显示,该菌与气单胞菌属Aeromonas细菌聚为一支。综合HLD01菌株各项生物学特征,将其鉴定为杀鲑气单胞菌无色亚种,该菌对庆大霉素、卡那霉素、菌必治、恩诺沙星等药物高度敏感,可参考选取以上药物来治疗和控制养殖大菱鲆溃疡病。     

奥尼罗非鱼无乳链球菌的鉴定、致病性及药物敏感性研究

从海南省某水产养殖场患病奥尼罗非鱼(Oreochromis aureus×Oreochromis niloticus)中,分离到1个编号为LFY-08-23的菌株。经过对分离菌株进行生理生化特性鉴定、Biolog系统鉴定以及利用原核生物16S rRNA基因通用引物进行16S rRNA基因的克隆及序列分析,结果发现LFY-08-23菌株与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的生理生化特性相似,16S rRNA基因克隆及序列分析结果与S.agalactiae(EF092913,DQ303183,AF459432)自然构成一个分支,相似性高达99.8%。用分离的S.agalactiaeLFY-08-23菌株对异育银鲫和斑点叉尾鮰进行人工感染试验,结果表明,当注射菌浓度达到1.0×109cfu/mL时,2种鱼全部死亡。S.agalactiaeLFY-08-23菌株对头孢氨噻肟、丙氟哌酸、利福平等13种药物高度敏感,对呋喃妥因、新生霉素、强力霉素等7种药物中度敏感,对卡那霉素、链霉素、磺胺异恶唑等5种药物不敏感。     

养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌的分离鉴定与系统发育分析

从患病的大菱鲆成鱼体内分离到一株致病菌(编号1101),经人工感染试验证实该菌具有较强的毒力(LD50=3.34×106CFU/mL),并能从病鱼中重新分离出此菌.应用API20E自动鉴定卡及16S rRNA序列分析等方法对该菌进行了综合鉴定.结果显示菌株1101为革兰氏染色阴性、氧化酶阴性、触酶阳性,API20E鉴定系统鉴定为迟缓爱德华氏菌,相似率达99%.测定了其16S rRNA序列,长度为1419 bp,在GenBank上经同源性比对与迟缓爱德华氏菌聚为一类,同源性达99%,据此鉴定为迟缓爱德华氏菌(Ewardsiela tarda).药敏试验结果表明菌株1101对多粘菌素较敏感,而对其它药物中度或不敏感.