绵羊Leptin基因的进化分析

[目的]为绵羊与其他动物的分子系统进化分析奠定基础。[方法]对绵羊Leptin基因的第23、外显子进行PCR扩增和测序,将测序结果与GenBank中绵羊和7个其他物种中相应序列进行比对,并构建绵羊与其他物种的分子系统进化树。[结果]不同物种的Leptin基因的核苷酸序列有较高的保守性。绵羊与山羊、水牛、奶牛、猪、人、家鼠、鸡的同源性分别为99.5%、98.0%、97.3%、93.4%、88.4%、83.9%、82.4%。系统发生树将这些物种总体上分成2支,家鼠与鸡聚为一支;而绵羊与山羊、水牛、猪和人为另一支。绵羊与山羊亲缘关系最近,而与水牛、奶牛、猪、人、家鼠、鸡亲缘关系渐远。[结论]Leptin基因适于进行物种起源、演化、分类以及系统发生关系的研究。     

绵羊BMPR-IB基因密码子使用偏好和适应性进化分析

探讨BMPR-IB编码特点可为提高外源基因在受体物种中稳定、高效表达提供重要依据。本研究运用CHIPS、CUPS和CodonW分析绵羊BMPR-IB基因序列,与不同物种BMPR-IB、模式生物基因组及其他多胎主效基因比较,构建进化树后,利用PAML分析BMPR-IB对环境的适应性。结果表明:绵羊BMPR-IB基因与多胎性状相关的主效基因及除人类、倭黑猩猩和家犬外的不同物种CDS序列中大部分偏好使用G/C结尾密码子,对17种密码子具有偏好性,偏好性较强的密码子为GTG(2.02);绵羊多胎性状相关的BMP-15、GDF-9主效基因,对27种密码子具有偏好性,使用频率最高的为TGT(2.79)。密码子偏好性的聚类结果类似于进化结果,且不同物种的BMPR-IB基因中性选择的作用比例较高;绵羊与3种模式生物基因组密码子使用频率比较发现,小鼠基因组优于酵母和大肠杆菌。本研究结果为今后进一步开展绵羊新基因的发现、功能基因表达调控研究等提供了理论基础。     

绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因的克隆和适应性进化分析

【目的】获得绿尾虹雉(Lophophorus lhuysii)Toll样受体5基因(TLR5)编码区序列,并对其编码区蛋白的特征及适应性进化进行分析。【方法】以绿尾虹雉基因组DNA为模板,采用PCR扩增克隆获得TLR5基因编码区序列。使用MEGA、PAML等软件对其序列特征及选择压力进行分析。【结果】绿尾虹雉TLR5基因编码区序列全长2 583 bp,共编码860个氨基酸,以亮氨酸含量最高(133/860),色氨酸含量最低(11/860)。编码蛋白为典型的Ⅰ型跨膜结构,包括富含LRRs结构域的胞外区、跨膜区和胞内TIR结构域。绿尾虹雉TLR5基因极其保守,与雉鸡(P. colchicus)的同源性最高(97.75%),与小白鹭(E. garzetta)同源性最低(85.17%)。采用位点-特异模型在胞外区共检测到3个正选择氨基酸位点(263F, 280K和645I)。【结论】绿尾虹雉TLR5基因编码区受到较强的纯净化压力,胞外区LRRs结构域可能为识别病原微生物的区域。     

藏绵羊孕酮受体基因第4外显子多态性分析

以391只藏绵羊为研究对象,采用PCR-SSCP技术分析孕酮受体(PGR)基因第4外显子在藏绵羊中单核苷酸多态性(SNPs),探讨PGR的生理功能及其对藏绵羊繁殖力的影响。结果表明:PGR基因扩增片段在藏绵羊品种中存在PCR-SSCP多态性,序列比对分析发现2个SNPs位点,全为颠换。在该群体中发现3种基因型,分别为AA、BB和AB,其中AA为优势基因型,A为优势等位基因。χ2独立性检验表明,PGR基因扩增片段上各基因型呈极显著差异。     

HIF-1α基因第10外显子对藏绵羊高原低氧适应性的影响

【目的】研究藏绵羊低氧诱导因子1α基因(HIF-1α)第10外显子的变异特征及其对藏绵羊血气和生化指标的影响,为藏绵羊低氧适应性机制研究提供基础。【方法】采用PCR-SSCP法对333只藏绵羊HIF-1α基因第10外显子变异进行分析;采用血气仪测定其中134只年龄基本一致成年母羊的血气和生化指标,分析HIF-1α基因第10外显子变异与藏绵羊血气和生化指标的相关性。【结果】藏绵羊HIF-1α基因第10外显子存在6个SNPs位点,其中4个SNPs为同义突变,位于编码区(c.1302CT、c.1392GA、c.1506TC和c.1515TG),另外2个SNPs位于非编码区(c.1545+26AG和c.1545+52GA)。6个SNPs构成A、B、C 3个等位基因,表现为AA、BB、AB、AC和BC 5种基因型,其中AB为优势基因型。遗传多样性分析表明,HIF-1α基因第10外显子多态信息含量为0.48,呈中度多态,并处于Hardy-Weinberg不平衡状态。HIF-1α基因第10外显子基因型对酸碱度(pH)、碱剩余(BE)、血氧饱和度(S(O_2))、血红蛋白总量(Hb)和半饱和氧分压(p_(50))影响显著。AB基因型藏绵羊在群体中比例最高,且具有较高的S(O_2)。与AB基因型藏绵羊相比,AA基因型藏绵羊BE和S(O_2)较低(P0.05),推测其高原低氧适应能力较弱。【结论】HIF-1α基因第10外显子变异与藏绵羊pH、BE、S(O_2)、Hb和p_(50)相关,推测AB基因型藏绵羊具有较好的高原低氧适应性,而AA基因型藏绵羊高原低氧适应能力较弱。     

绵羊脂肪型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)的变异研究

【目的】明确绵羊A-FABP(adipocyte fatty-acid binding protein,A-FABP)基因的变异和单倍型特征.【方法】基于Ensemble数据库中绵羊A-FABP基因全序列,对7个绵羊品种共20个样本的A-FABP基因全序列进行测序分析.【结果】PCR扩增获得绵羊A-FABP基因全长6474bp,A、T、G、C 4种碱基的比例分别为31.48%、33.02%、17.21%和18.29%,A+T平均含量为64.50%,G+C平均含量为35.50%;共发现48处单碱基变异位点和2处微卫星位点M1((TG)n)和M2((TA)n),单一变异位点、2核苷酸变异位点和3核苷酸变异位点比例分别为28.85%、40.4%和0.02%;共发现转换、颠换、插入和缺失4种变异类型,其占变异位点总数的比例分别为45.83%、31.25%、2.08%及20.83%;共发现19种单倍型,单倍型多样度为0.995.【结论】A-FABP基因19个单倍型序列的NJ树分化为2个聚类簇,表明A-FABP基因单倍型最初由2个主要单倍型衍化形成.     

绵羊LHβ基因生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对绵羊促黄体生成都（Luteinizinghormonebeta,￡邵）基因进行生物信息学分析。结果表明,绵羊LHβ基因含有1个426bp的开放阅读框,编码141个氨基酸;LHβ蛋白分子质量为15．2KD,理论等电点为7．47;工邵编码产物的二级结构主要以β折叠和无规则卷曲为主,主要位于细胞质中,作为一种激素参与机体的生殖调控。     

3个绵羊群体BMPR-IB基因多态性与产羔数的相关分析

[目的]为解决多胎肉用绵羊杂交育种技术的关键问题提供依据。[方法]以BMPR-IB基因作为候选基因,采用PCR-RFLP方法检测其在萨福克羊、小尾寒羊及萨寒F1代杂交羊中的多态性分布,分析其与产羔数的相关性。[结果]在萨福克绵羊中只有1种基因型野生型(++);在小尾寒羊中检测到3种基因型纯合突变型(BB)、杂合突变型(B+)和野生型(++),基因型频率分别为0.14、0.80和0.06。在萨寒杂交绵羊中,检测到2种基因型(B+和++),基因型频率分别为0.99和0.01。3种绵羊的产羔数差异极显著,萨寒杂交羊的多羔率和平均产羔率均明显高于纯种萨福克羊。[结论]BMPR-IB基因的遗传方式符合孟德尔遗传规律。利用小尾寒羊对萨福克羊的繁殖性能进行杂交改良是有效可行的。     

绵羊BMPR-IB基因单核苷酸多态性分析

BMPR-IB基因为绵羊产羔数的主效基因,以中国美利奴羊(军垦型)多胎品系为材料,利用PCR-SS-CP、PCR-RFLP和基因测序分析BMPR-IB基因5′非翻译区、编码区和3′非翻译区的单核苷酸多态性(SNPs),研究该基因SNP位点与绵羊高繁殖力的相关性。结果表明,BMPR-IB基因5′非翻译区不存在多态性,编码区存在2个碱基突变(746A→G和1113C→A),3′非翻译区存在1个碱基突变(1354A→G)。最小二乘模型分析表明,A746G突变对绵羊高产羔数的影响达到极显著程度(P0.001),A1354G突变对绵羊高产羔数的影响差异不显著(P0.05)。说明A746G位点能够用于高繁殖力中国美利奴羊(军垦型)多胎品系的选择。     

新疆地方绵羊品种Cytb基因遗传多样性与系统进化分析

[目的]为全面了解新疆地方绵羊品种的遗传多样性和系统发育关系,为后期选种、保种和种质资源合理利用提供理论依据.[方法]对新疆13个地方绵羊品种线粒体DNA细胞色素b(cytochrome b,cytb)基因序列进行PCR扩增和测序分析.[结果]除和田羊外,其余12个品种遗传多样性均较丰富;中性检验显示和田羊经历过种群扩...     

绵羊Dlx3基因启动子活性及其多态性与羊毛品质性状的关联

【目的】通过开展绵羊Dlx3基因启动子结构、活性、多态性及其与羊毛品质性状的关联等分析,揭示Dlx3基因在绵羊毛囊发育中的作用及其作用机制。【方法】采用PCR扩增Dlx3基因起始密码子上游1.5 kb区域,利用荧光素酶报告基因技术分析Dlx3基因启动子活性,采用测序方法寻找Dlx3基因启动子区SNP,并利用PCR-RFLP技术进行SNP分型。【结果】①Dlx3基因启动子近端序列的保守性较高,该区域内人、鼠及绵羊都具有23个保守的转录因子结合位点和一个CpG岛,而启动子的远端序列的保守性较低;②Dlx3基因的启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中具有启动子活性;③Dlx3基因启动子的-1 551—-1 108 bp与-1 108—-707 bp区域对启动子活性影响较大;④Dlx3基因启动子区SNP位点（G-1166A）多态性与羊毛卷曲度显著相关。【结论】①Dlx3基因启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中有活性;②Dlx3基因启动子的近端序列组成在人、鼠和绵羊中较为保守,而其远端序列的保守性较低,但是Dlx3基因启动子的远端序列对启动子活性影响较大;③Dlx3基因启动子区G-1166A位点是羊毛卷曲度的一个分子标记。     

5个绵羊群体的BMPR-IB基因多态性分析

选择骨形态发生蛋白受体IB基因(BMPR-IB)作为一种侯选基因.采用PCR-RFLP方法检测其在杜泊绵羊、湖羊、小尾寒羊及杜湖、杜寒杂交F1代群体中的多态性分布规律.结果显示:在杜泊绵羊中只存在1种基因型,即野生型( );在湖羊和小尾寒羊中检测到两种基因型,纯合突变型(BB)和杂合突变型(B );湖羊中BB、B 基因型频率分别为0.909和0.091,小尾寒羊中BB、B 基因型频率分别为0.563和0.437;在杜湖和杜寒杂交绵羊中发现两种基因型(B 和 ),杜湖羊B 和 基因型频率分别为0.875和0.125;杜寒羊B 和 基因型频率分别为0.786和0.214.BMPR-IB分子标记可作为一种新颖的辅助技术用于评估杜泊绵羊与湖羊或小尾寒羊杂交后代的繁殖力.     

藏绵羊DQA1基因多态性分析

 【目的】研究藏绵羊DQA1基因多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、氨基酸多态位点及各等位基因间的遗传关系,同时分析其进化意义。【方法】采用PCR-SSCP方法检测了900只藏绵羊DQA1基因第2外显子多态性;克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列,并分析序列数据。【结果】发现了17个DQA1的等位基因,包括缺失的1种基因,其中5个为发现的新等位基因。16个单倍型序列中发现56个核苷酸多态位点,27个氨基酸多态位点。【结论】藏绵羊DQA1基因第2外显子具有丰富的多态性,群体中可能蕴藏着更多的遗传资源;藏绵羊DQA1基因最初可能是由2个等位基因突变分化成两大类等位基因的;藏绵羊DQA1基因第2外显子序列与牛的DQA1基因第2外显子序列具有较高的同源性,预示绵羊和牛的DQA1基因最早可能来源于它们分歧以前的共同祖先原始序列;DQA1基因在与其相关的特定抗原刺激下发生的免疫应答反应在绵羊和牛上具有相似性;新等位基因C的139位发现了1个新的核苷酸突变位点（A/G）,属同义突变;5个新发现的DQA1等位基因遗传关系较近,可能由同一等位基因突变产生。     

绵羊LHβ基因多态性与繁殖性能的相关性

设计6对引物,采用PCR-SSCP技术检测促黄体素β基因(LHβ)5′调控区和外显子在高繁殖力绵羊品种(湖羊)和低繁殖力绵羊品种(陶赛特、特克赛尔和哈萨克)中的单核苷酸多态性(SNPs),并探讨该基因与湖羊繁殖力的关系。结果显示,在5′调控区发现4个多态性位点(286 bp T→C、424 bp A→G、439 bp T→C、705 bp G→A),在第2外显子区发现2个多态性位点(1 042 bp C→G、1 136 bp C→T),在第3外显子区内没有任何SNPs位点。研究初步表明,湖羊LHβ基因AB型的平均产羔数比AA型多0.45只(P0.05),GJ型的平均产羔数比GG型多1.83只(P0.05),EE型平均产羔数比EF型多0.03只,但差异不显著(P0.05);AB基因型初生重最小二乘均值比AA基因型多0.56 kg(P0.05),体高最小二乘均值比AA基因型多2.12 cm(P0.05);其他基因型的初生性状之间差异均不显著(P0.05)。     

ADRB3基因Trp64Arg多态性与日本民族原发性高血压无关

目的:研究高血压候选基因β3肾上腺素能受体基因β3-Adrenergic receptor(ADRB3)在日本人群的分布,并探讨ADRB3基因Trp64Arg多态性与原发性高血压病(essential hypertension,EH)的关系.方法:采用流行病学调查方法分析肥胖指数、血浆胆固醇和甘油三酯等临床指标,同时调查受检者吸烟和饮酒等生活习惯;Taqman-PCR法分析ADRB3基因Trp64Arg多态性在大样本日本人群(样本总数2 714人,其中HT组1 328例,非高血压组(NT)1 386例)的分布及其与临床指标间的相关性.结果:除总胆固醇外,其余指标如年龄、性别、肥胖指数、舒张期血压、收缩期血压、HDL-脂蛋白和甘油三酯等在Trp/Trp、Trp/Arg和Arg/Arg这3类基因型携带者中均无显著性差异;卡方检验结果显示ADRB3的Trp64Arg基因型(p=0.425)与等位基因频率(p=0.501)在HT与NT之间没有显著统计学意义;ADRB3的Trp64Arg基因多态性与高血压病Logistic回归模型分析结果显示,卡方值(wald)为0.356;比值比为0.884;95%的可信区间为0.589～1.326,p值为0.551.结论:按照p＜0.05统计学标准,ADRB3的Trp64Arg多态性可能与日本人群EH无关.

Abstract：

To investigate the correlation between Trp64Arg polymorphism in β3-adrenergic gene and essential hypertension (EH) in large scale Japanese, a case-control study consisting of 1 328 essential hypertensive subjects (HT) and 1 386 normotensive controls (NT) was performed. All subjects were urban residents randomly selected from the Ehime Prefecture of Japan. Body mass index (BMI) was recorded in the epidemiological investigation process, some biochemical indicators (HDL, LDL, triglyceride and cholesterol) were measured from the blood plasma of the subjects. Meanwhile, we investigated some life-style factors of the subjects, including smoking and alcohol use. The ADRB3 Trp64Arg polymorphisms were determined in DNA extracted from peripheral blood leukocytes by Taqman-polymerase chain reaction (Taqman-PCR). Except total cholesterol, the other indicators studied (age, sex, BMI, SBP, DBP and HDL)did not differ significantly among the Trp/Trp, Trp/Arg and Arg/Arg genotype carriers. Chi-square anal ysis showed no statistically significant differences in either genotype distribution (p=0. 425) or allele frequencies (p=0. 501) between hypertensive and normotensive subjects. The logistic regression model results demonstrated that there were no association between ADRB3 gene Trp64Arg polymorphisms and hypertension subjects, and Wald=0. 356, Odd=0.884, 95%CI was 0.589-1.326, and p=0.551. Therefore, the present study suggests that the ADRB3 gene Trp64Arg polymorphisms might not be significantly associated with hypertension in homogeneous Japanese.     

十字花科植物17个物种PIN3基因的系统进化分析

为了探明十字花科植物不同物种PIN3基因之间的进化差异,运用Brassica Database数据库及十字花科基因数据库在线平台,对拟南芥(Arabidopsis thaliala)、红花荠菜(Capsella rubella)、芜青(Brassica rapa)、油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)等17个已完成基因组测序的十字花科物种的18个(油菜含有2个)PIN3同源性基因进行分析,并对其推导的编码蛋白(PIN3)进行了系统进化分析。结果表明,18个PIN3序列间的相似性为86.74%,PIN3推导蛋白之间的相似度为90.93%,蛋白等电点约为7.15~9.44,芜青PIN3等电点明显偏高。PIN3的氨基酸比对分析结果表明,在多个糖基化位点出现具有种属差异性和符合进化关系的氨基酸替换现象,盐芥属植物中条叶蓝芥(Thellugiella parvula)PIN3在更多的位点出现氨基酸的替换,这可能是导致十字花科不同种属PIN3蛋白的功能和活性出现差异的原因。     

绵羊生长激素基因第4外显子的多态性分析

采用PCR-SSCP技术检测包括蒙古羊、小尾寒羊、德国美利奴羊以及德美寒杂交一代在内的绵羊生长激素(GH)基因第4外显子的多态性.结果表明:在1188~1502 bp片段上,德国美利奴羊及杂交后代中,AA型个体占多数,而小尾寒羊则以BB型个体为主.对这个片段的纯合型(AA,BB)分别进行克隆测序发现:1188~1502 bp片段上,AA型在第1406位发生了T→C的突变.实验结果证实绵羊生长激素基因第4外显子存在序列多态性.     

五个地方绵羊品种FAS基因3'-UTR区单核苷酸多态性研究

[目的]探究脂肪酸合成酶(FAS)基因3'端非翻译区(3'-U7R)在绵羊地方品种中的遗传多态性,为进一步揭示地方绵羊品种间遗传分化、开展肉质性状的关联分析和表达调控等研究提供依据.[方法]采用PCR-SSCP和DNA测序技术对兰州大尾羊(38只)、滩羊(58只)、甘加羊(40只)、欧拉羊(30只)和乔科羊(39只)五个地方绵羊品种205只个体的脂肪酸合成酶(FAS)基因3'-UTR进行单核苷酸多态性(SNPs)检测和遗传多态性分析.[结果]在这五个地方绵羊品种的FAS基因3'-UTR区中,有951位点和1005位点2个多态位点;两位点分别存在AA、Aa、aa和EE、Ee、ee各三种基因型,而aa和ee基因型未检测到;AA和EE基因型频率高于Aa和Ee基因型频率,基因型AA和EE为优势基因型;A和E两个等位基因频率高于a和e等位基因频率,为优势等位基因,适合性检验表明,这5个地方绵羊品种在951位点和1005位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态.独立性检验表明:在951位点,兰州大尾羊与滩羊、欧拉羊、甘加羊和乔科羊之间表现为差异显著(0.010.05);在1005位点兰州大尾羊、滩羊、欧拉羊、甘加羊和乔科羊品种之间均表现为差异不显著(P>0.05).测序结果表明,951位点在FAS基因在其转录产物Mrna的951位所对应处有一处C→T突变;1005位点在FAS基因在其转录产物Mrna的1005位所对应处有一处A→G突变.FAS基因Mrna二级结构预测结果显示:951位点的突变能导致其二级结构发生了明显的改变,而1005突变不会改变其二级结构.[结论]五个地方绵羊品种在FAS基因3'-UTR区有951位点(C→T)和1005位点(A→G)两个SNPs,2位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态;基因型频率分布的独立性检验结果表明,在951位点,兰州大尾羊与滩羊、欧拉羊、甘加羊和乔科羊之间表现为差异显著(0.010.05);在1005位点兰州大尾羊、滩羊、欧拉羊、甘加羊和乔科羊品种之间均表现为差异不显著(P>0.05).     

7个绵羊品种PGR基因第4外显子多态性分析

为探索绵羊PGR基因第4外显子的多态性,采用PCR-SSCP技术,对‘德克塞尔羊’、‘无角陶赛特羊’、‘小尾寒羊’、‘蒙古羊’、‘德国美利奴羊’、‘滩羊’和‘藏羊’7个绵羊品种共计414个个体的PGR基因第4外显子进行了遗传多态性检测分析.结果表明:绵羊PGR基因第4外显子存在多态性,发现了AA、BB和AB 3种基因型.不同基因型PCR产物测序结果显示,该多态的产生是由于PGR基因第4外显子扩增序列的第227bp处发生了C→T的碱基突变.基因型和基因频率统计结果表明,‘小尾寒羊’同时存在AA、BB和AB 3种基因型,‘无角陶赛特羊’和‘德国美利奴羊’只存在AA基因型,而其他品种存在AA和AB 2种基因型;在所检测的品种中,AA基因型为优势基因型,A等位基因均为优势等位基因.χ2适合性检验结果表明,7个绵羊品种在该基因座位都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05).不同基因型在7个绵羊品种间分布的独立性检验结果表明,在该位点,‘无角陶赛特羊’与‘藏羊’之间表现为差异极显著(P<0.01);‘无角陶赛特羊’与‘蒙古羊’和‘滩羊’之间,‘德国美利奴羊’与‘滩羊’和‘藏羊’之间均表现为差异显著(P<0.05);‘无角陶赛特羊’与‘德国美利奴羊’只发现同一种基因型,不存在差异;其他绵羊品种之间均表现为差异不显著(P>0.05).多态信息含量(PIC)分析结果表明,‘无角陶赛特羊’和‘德国美利奴羊’在该位点没有多态,其他属低度多态.