抗rmNDPK-B抗体的制备、纯化、鉴定及应用

为制备抗rmNDPK-B多克隆抗体,以纯化后的rmNDPK-B为抗原,改良法免疫新西兰免,琼脂双向扩散法分析抗体滴度,SDS-PAGE和Western-blot鉴定纯化后的抗体,结果发现,已获得高效价、高纯度的抗rmNDPK-B多克隆抗体;再分别以此抗体和抗rhNDPK-B抗体为一抗,Western-blot和免疫组织化学法检测小鼠子宫内膜组织中的NDPK-B的表达和分布.结果提示,在检测妊娠小鼠子宫内膜组织NDPK B的表达时,抗rmNDPK-B抗体的特异性明显高于抗rhNDPK-B抗体.妊娠小鼠子宫内膜组织NDPK-B的表达显著高于非妊娠鼠.这表明用改良法制备的抗rmNDPK-B多克隆抗体具有高特异性、高效价和较高的灵敏性.nm23-M2/NDPK-B可能参与了胚泡着床过程.     

杀虫剂西维因特异性多克隆抗体的制备及鉴定

采用室内实验方法,合成了保留有西维因分子结构特性的半抗原———6-(1-萘氧基甲酰胺)-己酸,将其与BSA偶联后免疫两只兔,获得了特异性的西维因多克隆抗体。对抗体进行纯化及鉴定,在优化条件下,用间接酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测了西维因的浓度,西维因的最低检测限达14ng·mL-1。     

抗重金属镉多克隆抗体的制备及纯化

镉是生物毒性最强的重金属之一,动物性食品中的重金属镉残留给人类健康带来了巨大危害,建立高效、快速的重金属镉免疫学检测技术对保障食品安全和人类健康具有十分重要的意义。本研究运用双功能螯合剂DTPA、镉离子标准溶液和牛血清白蛋白(BSA)制备重金属镉的完全抗原Cd-DTPA-BSA,以其为免疫抗原加入弗氏佐剂乳化后免疫家兔,制备抗重金属镉多克隆抗体,并运用凝胶柱层析法纯化抗重金属镉多克隆抗体,SDS-PAGE结果显示多克隆抗体的纯化效果较好,Dot-ELISA测定纯化后多克隆抗体的效价达到1∶1 600。该研究为动物性食品中重金属铅ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

骆驼重链抗体特异性多抗的制备及鉴定

目的:骆驼血清中除了常规抗体Ig G1,还存在两种天然缺失轻链的重链抗体Ig G2和Ig G3,其具有分子量小、稳定性强等优点,但由于缺乏有效的检测手段,使其研究和应用受到了一定的限制,因此制备针对骆驼重链抗体的多抗将具有一定应用前景。方法:本实验中,我们从骆驼抗凝血中分离骆驼血浆,经过Protein G/A Resin柱子对骆驼3种亚型抗体进行了分离和纯化。利用纯化的骆驼Ig G2对家兔进行3次免疫制备了针对骆驼重链抗体的多克隆抗体,并对其活性进行了鉴定。结果:SDS-PAGE凝胶电泳检测结果显示我们成功分离到了骆驼各亚型抗体。间接ELISA测定多抗效价为1:4 096,再通过间接ELISA和Western-blot方法测定多抗的特异性,结果显示制备的多克隆抗体与牛Ig G以及骆驼Ig G1无交叉反应,而与Ig G3抗体具有交叉反应性。结论:实验结果显示我们成功制备了骆驼重链抗体特异性多克隆抗体,将对骆驼抗体资源的开发、利用及对骆驼疾病的检测和研究提供有力支持。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

克伦特罗多克隆抗体的制备与鉴定

以重氮法合成克伦特罗（CL）免疫抗原,以戊二醛法合成包被抗原。免疫新西兰兔制备克伦特罗抗体,建立了克伦特罗酶联免疫吸附分析法（ELISA）,标准曲线具有良好的线性关系,该抗体与沙丁胺醇、特布他林的交叉反应率分别为83.44%和80.23%。表明该抗体可以用于对β-兴奋剂类药物进行多残留快速检测。     

大肠杆菌内毒素多克隆抗体的制备与纯化

为制备大肠杆菌内毒素多克隆抗体,应用大肠杆菌内毒素作为抗原免疫5周龄家兔,辛酸-硫酸铵法和葡聚糖凝胶层析法分离提纯抗血清,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳方法鉴定多抗纯度,紫外分光光度计测定抗体蛋白含量,ELISA法检测抗血清效价与交叉反应;大肠杆菌内毒素抗体含量和效价分别为6.95mg/ml和1:12800;成功制备出抗大肠杆菌内毒素多克隆抗体,为大肠杆菌内毒素病诊断试剂盒的研制奠定基础。     

Harpinxoo多克隆抗体制备、鉴定与应用

 以纯化harpin蛋白为抗原免疫新西兰白兔，制备兔抗Harpin蛋白的多克隆抗体，经ELISA法测定抗体效价为1：2000，经亲和层析纯化，Western blot分析制备抗体与原核细胞体外表达的harpin蛋白可以特异性结合，表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证harpin编码基因在转基因水稻中在翻译水平的正常表达。因此，兔抗harpin抗体的成功制备，为进一步深入研究harpin的生物学功能、细胞定位以及在其他植物中的表达等奠定基础。     

抗阿莫西林多克隆抗体的制备

[目的]为研究阿莫西林残留的免疫学检测方法奠定基础。[方法]采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法将阿莫西林分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原AMX-BSA和检测抗原AMX-OVA,用AMX-BSA免疫成年兔以获得高效价的多克隆抗体。[结果]免疫抗原AMX-BSA紫外光谱具有药物和蛋白的叠加特征,其最大吸收峰在276 nm处,说明载体蛋白BSA与AMX成功偶联,可用于动物免疫。检测抗原AMX-OVA最大吸收峰在275 nm处,说明载体蛋白OVA与AMX成功偶联,可用作检测抗原进行包被。间接ELISA检测结果表明,2只兔抗血清效价较高,均达1∶32 000以上,说明有特异性抗体产生。[结论]该研究成功制备了抗阿莫西林多克隆抗体,也进一步证明药物偶联成功。     

Prokaryotic Expression, Ascitic Polyclonal Antibody Preparation and Identification of Cashmere Goat Izumol

Izumol is a novel member of the immunoglobulin superfamily locating on sperm, and is indispensable for sperm-egg fusion. According to its immunoglobulin-like domain in the extracellular region, Izumol was fractionated into 6 fragments （F0-F5） which were ligated with pGEX-4T1 to construct the prokaryotic expression vectors pGEX-Fn. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 （DE3） and the GST-Fn fusion proteins were expressed successfully by induction with IPTG. GST-F0, a recombinant fusion protein of GST with the full length of extracellular region of mature cashmere goat Izumol, was purified by polyacrylamide gel slicing method and was used as an antigen to immunize the Kunming mouse to generate anti-GST-Izumol ascetic polyclonal antibody with intraperitoneal injection of S 180 cells. Subsequently, the anti-GST-Izumol polyclonal antibody was purified with miscellaneous antigen by glutaraldehyde cross-linking method. Western blotting analysis showed that the purified ascetic polyclonal antibody had high affinity to all 6 GST-Izumol fragment fusion proteins. Immunohistochemical analysis with this antibody displayed that the cashmere goat Izumol proteins were at the equatorial segment of sperm head surface. These results indicate that this polyclonal antibody has high specificity and lays the foundations for further study on the expression pattern of Izumol in cashmere goat testis and binding abilities of each extra-membrane fragment of Izumol to the egg surface.     

Prokaryotic Expression, Ascitic Polyclonal Antibody Preparation and Identification of Cashmere Goat Izumo1

Izumol is a novel member of the immunoglobulin superfamily locating on sperm, and is indispensable for sperm-egg fusion. According to its immunoglobulin-like domain in the extracellular region, Izumol was fractionated into 6 fragments (F0-F5) which were ligated with pGEX-4Tl to construct the prokaryotic expression vectors pGEX-Fn. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) and the GST-Fn fusion proteins were expressed successfully by induction with IPTG. GST-FO, a recombinant fusion protein of GST with the full length of extracellular region of mature cashmere goat Izumol, was purified by polyacrylamide gel slicing method and was used as an antigen to immunize the Kunming mouse to generate anti-GST-Izumo1 ascetic polyclonal antibody with intraperitoneal injection of SI80 cells. Subsequently, the anti-GST-Izumol polyclonal antibody was purified with miscellaneous antigen by glutaraldehyde cross-linking method. Western blotting analysis showed that the purified ascetic polyclonal antibody had high affinity to all 6 GST-Izumo1 fragment fusion proteins. Immunohistochemical analysis with this antibody displayed that the cashmere goat Izumol proteins were at the equatorial segment of sperm head surface. These results indicate that this polyclonal antibody has high specificity and lays the foundations for further study on the expression pattern of Izumol in cashmere goat testis and binding abilities of each extra-membrane fragment of Izumol to the egg surface.     

碳二亚胺法制备阿莫西林人工抗原及其鉴定

合成、鉴定了阿莫西林(amoxicillin,AMO)人工抗原,并通过动物免疫法生产了亲和力高、特异性好的鼠源AMO多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将AMO分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成完全免疫抗原AMO-BSA和检测抗原AMO-OVA,经紫外分光光度法和SDS-PAGE以及动物免疫进行鉴定。结果表明,偶联后的紫外吸收峰与BSA和AMO相比都发生了一定的位移,AMO-BSA在276nm处出现最大吸收峰,BSA的泳动速度大于AMO-BSA。免疫后获得的3只小鼠多抗血清,通过间接竞争ELISA测定,效价可达1×10-4以上,1号小鼠半数抑制浓度(IC50)为573.75ng/mL,敏感性较好。AMO完全人工抗原的合成以及鼠源多克隆抗体血清的制备,为AMO单克隆抗体的制备奠定了基础。     

恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质(PF3D7_0811600)的表达纯化及其多克隆抗体的制备

利用大肠杆菌原核表达并纯化恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600,免疫家兔制备特异性多克隆抗体,通过对虫体天然蛋白的识别,分析PF3D7_0811600在虫体内的表达。采用PCR技术从恶性疟原虫3D7株总DNA中获得PF3D7_0811600基因的目的片段,连接到p MD18-T克隆载体,得到的克隆质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建重组原核表达质粒p ET-PF3D7_0811600和p GEX-PF3D7_0811600,通过优化表达条件,分别在大肠杆菌中得到高效表达,并用亲和层析柱纯化目的蛋白质。用纯化的His标签重组蛋白质免疫家兔,用Western Blot方法检测制备的特异性多克隆抗体。结果表明:成功纯化并获得重组蛋白质,用间接ELISA方法检测多抗效价达到1∶16 000,用Western Blot检测结果表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性,能够识别虫体天然蛋白。恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600在虫体晚期表达,说明该蛋白在虫体发育的晚期发挥重要作用,猜测其可能与裂殖子入侵宿主红细胞有关。     

猪型布鲁氏菌rBLS重组蛋白的纯化与抗体制备

以猪型布鲁氏菌的BLS分子作为研究对象,通过重组蛋白质的纯化以及多克隆抗体的制备,研究了重组rBLS分子的免疫原性。结果表明：布鲁氏菌BLS分子具有较好的抗原性质,可以刺激家兔产生相应的抗体。     

氯霉素人工多克隆抗体的制备、纯化与特性分析

通过合成氯霉素完全抗原,制备氯霉素的多克隆人工抗体,建立氯霉素(CAP)的免疫学检测方法。采用重氮法合成氯霉素完全抗原,以氯霉素牛血清白蛋白(CAP-BSA)免疫大耳白家兔,用ELISA方法进行鉴定和特性分析。结果显示,该抗血清与链霉素、青霉素、四环素等常见抗生素的交叉反应率均小于2.1%,IC50为13.65 ng/ml,检测限达到1.01μg/L。获得了选择性好、特异性较高的氯霉素特异抗体,可用于氯霉素的快速定量检测。     

丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

摘 要：利用偶联方法合成丙烯酰胺人工抗原,通过免疫方法获得抗丙烯酰胺多克隆抗体;应用戊二醛法将丙烯酰胺与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,并对这两种物质及其复合物进行紫外扫描,并用此复合物免疫兔子,利用间接酶联免疫吸附法测定抗体的效价;应用牛血清白蛋白与丙烯酰胺偶联人工抗体成功,抗体效价大于8100;应用人工抗原免疫成功制备抗丙烯酰胺多克隆抗体。     

Preparation, Characterization, and Application of Antiharpin xoo Antibody

Polyclonal antiharpinxoo rabbit antibody has been prepared successfully using purified harpinxoo protein as an immunogen. The ELISA titer of the antiserum against harpinxoo was about 1：2 000. Western blot analysis showed that the antiserum could bind to the expression harpinxoo protein in particular, hrfl, encoding harpinxoo, is an expression in transgenic rice, detected by antiharpinxoo rabbit antibody. The rabbit antibody against harpinxoo can be used to study further about the biological function, harpinxoo localization, and hrfl gene expression in other plants.