迟钝爱德华氏菌黏附及侵袭特性的研究

将引发养殖大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症的病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda(L-49231)接种于体外培养细胞——人上皮角质层形成细胞(HaCaT-cell),观察其对细胞的黏附性和侵袭性,研究了不同作用时间下以及用不同因素处理菌体后,细菌对HaCaT细胞黏附性及侵袭性的影响。结果表明:L-49231菌株能黏附HaCaT细胞,2 h后即可侵入细胞;随着作用时间的延长,细菌黏附细胞与侵入细胞的数量增加。分别用甲醛、戊二醛、盐酸、胰蛋白酶处理L-49231菌体,细菌的黏附力及侵袭力均有所下降;用蔗糖、甘露糖处理L-49231菌体时,细菌的黏附力变化不大;用葡萄糖处理时,能够促进细菌对细胞的黏附作用。用甘露糖和葡萄糖处理菌体时,能促进细菌对细胞的侵袭;用蔗糖处理菌体时,能部分抑制细菌对细胞的侵袭作用。用抗体处理L-49231菌体后,细菌的黏附力及侵袭力均明显下降。说明L-49231菌株对HaCaT细胞具明显的侵袭性,其主要黏附因子为胞外蛋白质成分,无确切的糖受体。     

迟钝爱德华氏菌鞭毛蛋白的提取与分析

采用不同的方法提取迟钝爱德华氏菌鞭毛蛋白(Edwardsiella Tardaflagellin,ETF),选出合适的方法提取ETF,同时制备了ETF的鼠抗血清和迟钝爱德华氏菌菌株ETY全菌的鼠抗血清,通过ELISA法和Western blottig法分析了ETF的抗原性和免疫原性。试验结果表明,酸化高速离心法可获得高纯度分子量约为44 kDa的ETF,该蛋白可被爱德华氏菌的全菌鼠抗血清识别,同时由ETF制备的鼠抗血清除了能特异识别该蛋白之外,也可识别爱德华菌菌体裂解产物中44 kDa的蛋白,证实爱德华氏菌鞭毛蛋白具有抗原性和免疫原性,可作为亚单位疫苗的候选抗原。     

提高迟钝爱德华氏菌细胞生物量的发酵条件研究

以胰大豆蛋白胨培养基(TSB)为基础培养基,采用单因素和正交试验方法优化提高鳗源迟钝爱德华氏菌ETY细胞生物量的培养基与培养条件。通过试验,获得迟钝爱德华氏菌ETY的优化培养基配方为1 000mL水加入葡萄糖3.0g、胰蛋白胨10.0g、鱼粉蛋白胨10.0g、磷酸氢二钾2.5g、氯化钠5.0g;培养条件优化结果为接种量8%、温度25℃、pH 7.5、转速200r.min-1。迟钝爱德华氏菌ETY在此条件下培养20h,细胞生物量达1.575×1010 cfu.mL-1,较优化前培养的细胞生物量5.200×109 cfu.mL-1提高3倍。每吨液体培养基的成本较优化前下降41.36%。     

迟钝爱德华氏菌的分离鉴定及体外抑菌效果研究

从患病金鳟体内分离得到一株菌株,经16S rRNA定为迟钝爱德华菌,并对其进行体外抑菌实验研究.采用水提法、水浸法、醇提法、超声醇提法4种方法制备大黄和五倍子中药原液,并用滤纸片法和二倍稀释法测定其对迟钝爱德华氏菌的体外抑菌活性.结果表明,五倍子和大黄对迟钝爱德华氏菌均有抑菌活性,五倍子抑菌效果优于大黄.五倍子以醇提法的抑菌效果最好,其抑菌圈直径为22.617±1.493 mm,最小抑菌浓度(MIC)为7.8125 mg/mL;大黄以超声醇提法抑菌效果最好,其抑菌圈直径为(12.193±0.688)mm,最小抑菌浓度(MIC)为125 mg/mL.结论:大黄和五倍子对迟钝爱德华氏菌有抑菌作用,五倍子抑菌效果优于大黄.     

迟缓爱德华氏菌的粘附特性

用绵羊红细胞对不同来源的１５株迟缓爱德华氏菌作血凝试验。结果表明，１５株ＥＴ均具有血凝性，且不能为甘露糖，蔗糖，葡萄糖所抑制。分别用甲醛，戊二醛，胰蛋白酶处理ＥＴ的模式菌株ＥＴ９９菌体，能抑制细菌血凝。提纯的ＥＴ９９菌株的鞭毛蛋白，外膜蛋白均无血凝性。同时用ＨＥｐ－２细胞分析了１５株ＥＴ的细胞粘附特性。结果表明，有１０株ＥＴ能粘附ＨＥｐ－２细胞、粘附菌数大于１０ＣＦＵ／细胞。分别用甲醛，戊二醛，胰     

鲫鱼鳃中迟钝爱德华氏菌的分离与鉴定

以市售鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象,从鳃中分离获得一株细菌,编号为Et-1,通过细菌形态学观察、理化特征鉴定、16S rDNA克隆测序及系统发育进化树构建等方法进行系统鉴定,结果表明Et-1菌株为革兰阴性杆菌,进一步PCR扩增Et-1菌株的16S rDNA序列为1 508 bp;系统进化树分析表明,Et-1菌株与迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)亲缘关系最近,自然聚为一支,序列同源性达98.7％～100％,最终确定Et-1为迟钝爱德华氏菌.     

地图鱼迟钝爱德华氏菌病病原菌的鉴定及毒力基因的检测

从患病地图鱼Astronotus ocellatus肝脏组织中分离到菌株AO1,经人工感染试验证实其为致病菌。通过ATB Expression半自动细菌鉴定仪和常规生理生化特性的分析,初步鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌Ed-wardsiella tarda。测定菌株AO1的16S rRNA基因序列并进行分析,结果显示,该菌株与迟钝爱德华氏菌的同源性最高,达99.9%。因此,可鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌。根据迟钝爱德华氏菌的毒力基因菌毛亚基(fimA)基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到383 bp序列,该序列与迟钝爱德华氏菌的fimA基因序列相似性达99.0%,进一步说明菌株AO1具有fimA基因,有一定的致病力。药物敏感试验结果表明,菌株AO1对阿米卡星、氧氟沙星、庆大霉素、新生霉素、氨苄西林、氨曲南、卡那霉素、头孢咪啉、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、妥布霉素、氨苄青霉素13种抗生素较为敏感。     

迟钝爱德华氏菌外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性

构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。     

迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda L-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况.结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank 中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99％、97％、99％、99％、99％、98％;通过优化反应条件,在退火温度为54 ℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因.表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株.     

地图鱼迟钝爱德华氏菌病病原菌的鉴定及毒力基因的检测

从患病地图鱼Astronotus ocellatus肝脏组织中分离到菌株AO1,经人工感染试验证实其为致病菌。通过ATB Expression半自动细菌鉴定仪和常规生理生化特性的分析,初步鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌Ed-wardsiella tarda。测定菌株AO1的16S rRNA基因序列并进行分析,结果显示,该菌株与迟钝爱德华氏菌的同源性最高,达99.9%。因此,可鉴定该菌株为迟钝爱德华氏菌。根据迟钝爱德华氏菌的毒力基因菌毛亚基(fimA)基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到383 bp序列,该序列与迟钝爱德华氏菌的fimA基因序列相似性达99.0%,进一步说明菌株AO1具有fimA基因,有一定的致病力。药物敏感试验结果表明,菌株AO1对阿米卡星、氧氟沙星、庆大霉素、新生霉素、氨苄西林、氨曲南、卡那霉素、头孢咪啉、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、妥布霉素、氨苄青霉素13种抗生素较为敏感。     

养殖大菱鲆出血性败血症病原菌致病性的研究及鉴定

从全身弥漫性出血合并腹水的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus的腹水、肝脏和肾脏中分离到3株菌落形态相同的优势菌,编号为L-49231、L-59231、L-59232。选用L-49231菌,通过注射、浸泡和灌喂3种途径分别对两种规格(全长(12±2)cm,体重(30±2)g;全长(18±2)cm,体重(125±5)g)的养殖大菱鲆进行人工感染试验,结果证实:此菌可经上述3种途径造成该病的发生,注射和浸泡方式的感染率均为100%,死亡率分别为100%和66.7%;灌喂方式未见死亡,感染率为85.7%。该菌经革兰氏染色为阴性,杆状,大小为2~3μm×1~1.2μm,周生鞭毛,兼性厌氧,接触酶为阳性,氧化酶为阴性,V.P试验为阴性。根据《常见细菌系统鉴定手册》所描述的爱德华氏菌属的生理生化特性,菌株L-49231为迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda。     

鸡抗迟缓爱德华氏菌卵黄抗体的应用研究

从全身出血合并腹水的养殖大菱鲆Scophthalmus maximus体内分离出1株细菌,经感染试验证实其病原性,并鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda。采用该菌制成全菌油乳性灭活疫苗,分4次给蛋鸡进行免疫注射,第2次加强免疫后开始收集鸡蛋,制备卵黄抗体(IgY)和其水溶性组分(W SF),并用试管凝集法测定其效价。取效价达到1∶64的鸡蛋提取卵黄抗体,分别采用口服和腹腔注射两种方式给大菱鲆进行免疫:配成含W SF 1 mL/g的饵料,给鱼连续投喂15 d;用含蛋白含量0.19 mg/mL的纯化IgY,于第1、3、14 d对大菱鲆进行腹腔注射,剂量为0.1 mL尾/。免疫后分别用注射和划伤浸泡两种方法攻毒。结果表明,口服特异性卵黄抗体对大菱鲆的免疫保护率分别为83.3%和100%,而注射免疫没有保护作用。     

迟钝爱德华菌鞭毛基因克隆表达及其免疫学活性分析

从鳗源迟钝爱德华菌Edwardsiella tarda菌株ETY的基因组克隆到其鞭毛基因(flagella gene,ETF)。该基因开放阅读框为1 257bp,编码419个氨基酸,推导的蛋白分子量为43.951kD。ELISA和Western-blotting试验证实表达的蛋白与迟钝爱德华菌菌株ETY表达的鞭毛蛋白具有相同的抗原性和免疫原性。免疫攻毒保护试验证明:经表达产物(ETF-rxA融合蛋白)与ISA佐剂结合免疫的日本鳗鲡对爱德华菌ETY的免疫保护率可达到100%。本试验首次成功实现了ETF基因的高效表达,并初步证实了迟钝爱德华菌鞭毛可诱导产生免疫保护,为进一步研制合适的高效的迟钝爱德华菌鞭毛亚单位疫苗奠定了基础。     

培养及提取条件对迟缓爱德华菌外膜蛋白的影响

提取迟缓爱德华菌（Et)外膜蛋白（OMP），经SDS-PAGE分析发现，在不同培养温度、时间、pH值及不同培养基上OMP图谱无明显差异，主条带是35000和40000。但在铁限制环境下，增加了高分子区域带98000，93000，75800及72400，而45000条带变细变浅。用去污剂Triton X-100和Sackosyl抽提OMP，条带基本相似，后者主条带更浓密。用SDS抽提OMP，则仅有35000条带。将OMP样品分别在37，50，70，90及100℃加热5min后点样，45000条带持续出现，35000在70℃以上开始出现，在90℃和100℃浓集，提示35000条带是热修饰微孔蛋白。     

抗生素对迟钝爱德华氏菌的体外抑菌试验

［目的］研究12种抗生素及8组联合药物对迟钝爱德华氏菌体外抑菌效果,为治疗鱼类爱德华氏菌病提供参考。［方法］采用试管二倍稀释法,通过测定抗生素对迟钝爱德华氏菌的最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）,筛选适宜抗生素。［结果］硫酸庆大霉素、卡那霉素硫酸盐、盐酸四环素的抑菌效果最好,其MIC分别为0.05、0.80、1.60 μg/ml,MBC分别为0.05、3.20、100.00 μg/ml。联合药物中硫酸庆大霉素＋羧苄青霉素、硫酸庆大霉素＋盐酸四环素、氨苄青霉素＋链霉素的抑菌效果最好,其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度均为0.05 μg/ml。［结论］通过抗生素对爱德华氏菌的体外抑菌效果,确定单独使用选择硫酸庆大霉素、卡那霉素硫酸盐、盐酸四环素,联合药物选择硫酸庆大霉素＋羧苄青霉素、硫酸庆大霉素＋盐酸四环素、氨苄青霉素＋链霉素较适宜。     

斑马鱼迟缓爱德华氏菌的鉴定、致病性及药物敏感性

从患病斑马鱼(Danio rerio)肝脏组织分离到菌株Z1,通过对该菌株形态特征、生理生化特性、ATB系统鉴定和16S rRNA、DNA促旋酶B亚单位蛋白(gyrB)基因测序等综合分析,鉴定Z1菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda).Z1菌株对健康斑马鱼和透明四带无须鲃(Puntius tetrazona)人工感染试验发现,感染发病症状与自然发病症状一致,再分离菌株的特性与Z1菌株相同,并再次感染成功,证实迟缓爱德华氏菌为斑马鱼病原菌.药敏试验发现Z1菌株对呋喃妥因等11种药物敏感,对苯唑西林等6种药物耐受.15种中草药对Z1菌株的体外抑菌试验结果发现,五倍子、石榴皮的抑菌作用明显,最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)均≤6.25 mg/mL;艾叶等有一定抑菌作用,MIC和MBC均在25～200 mg/mL;而野菊花等抑菌作用不明显,MBC＞200 mg/mL.     

鱼类致病性迟钝爱德华氏菌中多药抗性质粒pEIB202的消除

[目的]考察迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）EIB202中大质粒pEIB202在其致病过程中的作用,将质粒pEIB202消除,为开发抗迟钝爱德华氏菌病的安全减毒的活疫苗打下良好基础。[方法]采用同源重组技术以sacB为反向筛选标记消除质粒。[结果]对质粒pEIB202进行序列分析,发现该质粒编码多种抗性基因及部分VI型分泌系统（T4SS）组分,暗示该质粒可能与E.tarda的多重耐药性及致病力相关;质粒消除菌株EIB202Δp丧失氯霉素及四环素抗性,在生长、毒力、胞外蛋白分泌等方面与野生株无显著差异。[结论]PEIB202质粒是造成EIB202多重耐药性的主要原因,在其致病过程中可能并不起直接作用。     

鱼类致病性迟钝爱德华氏菌中多药抗性质粒pEIB202的消除(英文)

[目的]考察迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)EIB202中大质粒pEIB202在其致病过程中的作用,将质粒pEIB202消除,为开发抗迟钝爱德华氏菌病的安全减毒的活疫苗打下良好基础。[方法]采用同源重组技术以sacB为反向筛选标记消除质粒。[结果]对质粒pEIB202进行序列分析,发现该质粒编码多种抗性基因及部分Ⅵ型分泌系统(T4SS)组分,说明该质粒可能与E.tarda的多重耐药性及致病力相关。质粒消除菌株EIB202Δp丧失氯霉素及四环素抗性,在生长、毒力、胞外蛋白分泌等方面与野生株无显著差异。[结论]pEIB202质粒是造成EIB202多重耐药性的主要原因,在其致病过程中可能并不起直接作用。     

鮰爱德华菌hcp基因的克隆及重组表达

通过克隆获得鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluri LH51溶血素共调节蛋白(Hcp)编码基因hcp,该基因全长为489 bp,编码163个氨基酸,hcp编码蛋白的理论相对分子质量为17 800,等电点为5.21。氨基酸序列分析结果表明,鮰爱德华菌hcp基因与迟钝爱德华菌Edwardsiella tarda毒力蛋白EvpC(Hcp同源物)、发光杆菌Photorhabdus luminescens hcp基因等具有高度同源性。将鮰爱德华菌Hcp氨基酸序列连接至pGS-21a表达载体中,成功构建了pGS-21 a-hcp原核表达质粒;再将表达质粒转化至BL21(DE3)菌株后,经IPTG诱导、镍柱层析纯化获得大量携带GST和组氨酸双标签的融合蛋白。经SDS-PAGE和Western blot分析,确认获得了相对分子质量约为45 000的融合蛋白,并成功制备了具有较高效价的多克隆抗体。