胚胎干细胞显微注射对小鼠和猪胚胎发育影响的研究

旨在为小鼠和猪多能性干细胞嵌合体制作提供参考,探讨胚胎干细胞(Embryonic stem cells或Embryonic germ cells,ES/EG)显微注射及受体胚胎发育时期等对胚胎发育的影响。对小鼠ES细胞和猪EG细胞分别进行研究:(1)将小鼠ES细胞分别注入小鼠桑椹胚和囊胚,比较不同发育时期受体胚胎体外培养的发育率和孵化率,以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的发育率和孵化率。结果表明,显微注射后的桑椹胚体外培养发育率和孵化率分别为94.7%和70.2%,囊胚率分别为84.6%和80.8%,注射后桑椹胚体外培养发育率极显著高于囊胚(P0.01),但注射后囊胚体外培养孵化率极显著高于桑椹胚(P0.01);未注射胚胎(注射胚胎)的体外培养发育率和孵化率分别为96.6%(89.9%)和67.8%(75.2%),未注射胚胎发育率极显著高于注射胚胎(P0.01),但注射胚胎孵化率极显著高于未注射胚胎(P0.01)。(2)将猪EG细胞分别注入猪桑椹胚、早囊、囊胚及孵化囊胚,比较不同发育时期受体胚胎移植后妊娠率以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的孵化率,并对猪EG细胞显微注射针和固定针的规格进行了探讨。结果表明,显微注射的桑椹胚、早囊及囊胚移植后妊娠率为67%,而显微注射的孵化囊胚移植妊娠率为0,桑椹胚、早囊及囊胚移植后受体母猪妊娠率极显著高于孵化囊胚(P0.01),由桑椹胚、早囊及囊胚注射后移植获得了两头嵌合体仔猪;显微注射和未显微注射的猪胚胎其孵化率分别为47.54%和72.97%,未注射胚胎孵化率极显著高于注射胚胎(P0.01)。确定猪EG嵌合体制作过程中,注射针外径约为30μm,内径约为25μm;固定针外直径约为130~150μm,内径约为40μm。嵌合体制作时,胚龄宜早不宜迟,桑椹胚显微注射更易操作,而且导入的时期较早,ES/EG细胞在嵌合体组织中可以有很高的贡献率,故选择桑椹胚进行注射。在本试验条件下,显微注射对小鼠胚胎发育影响不大,对猪胚胎影响较大,说明猪胚胎显微注射条件需要进一步优化。     

原始生殖细胞与胚胎干细胞

原始生殖细胞用于哺乳动物胚干细胞的分离与培养,是进入９０年代以来胚胎干细胞研究领域内的重大技术成果。在小鼠、大鼠、牛和猪等动物上,人们已由ＰＧＣｓ成功地建立了类ＥＳ细胞系。囊胚注射不仅已生出嵌合小鼠,而且其中生殖系嵌合体也已繁殖出数量可观的后代。因此,来自ＰＧＣｓ的ＥＳ细胞,业已证明具有囊胚ＥＳ细胞的全部特性。在ＥＳ细胞培养中,用ＰＧＣｓ替代桑椹胚和囊胚在取材等方面是有优势的。     

川楝素对昆明小鼠的胚胎毒性研究

取体重18~25 g雌鼠,超数排卵后与公鼠合笼。获得的孕鼠随机分为 6 组,分别用于研究川楝素对孕鼠2 细胞胚、桑椹胚、囊胚3个时期胚胎的毒性。每个时期均设对照组,以小鼠腹腔注射1/30半数致死量(LD50)的川楝素剂量对以上3个时期试验组孕鼠染毒2次,对照组孕鼠用等量PBS注射。研究其着床时期胚胎毒性时不对小鼠进行超数排卵,但试验组孕鼠染毒3次,对照组孕鼠用等量PBS注射。最后计数、观察4个时期孕鼠子宫内的胚胎数量和形态。结果表明:2 细胞胚、桑椹胚、囊胚时期试验组胚胎总数与对照组相比,没有统计学上差异(P>0 05); 2 细胞期试验组正常胚胎、异常胚胎数量与对照组相比,也无统计学上的差异(P> 0 05);桑椹胚、囊胚时期试验组正常胚胎、异常胚胎数量与对照组相比,具有极显著差异(P<0 01)。3 次染毒对着床后的胚胎毒性最大,子宫内胚胎几乎全部溶解,无法计数。母体组织病理切片观察发现川楝素对主要器官心、肝、肺、肾、子宫仅有轻微损害,提示腹腔注射小剂量川楝素对怀孕小鼠具有特定的胚胎毒性。     

免疫外科法分离山羊囊胚内细胞团的研究

分别用关中奶山羊脾脏细胞和胎儿成纤维细胞,免疫新西兰白兔各2只,共4只。通过3次静脉注射,每次注射4×108个细胞,间隔10 d,最后一次注射10 d后心脏采血制备抗血清,结果获得的4份抗血清均具有细胞毒性,由脾脏细胞免疫获得的抗血清溶解细胞的效价稍高。超排关中奶山羊24只和波尔山羊3只,6~9 d采胚共获得胚胎240枚,其中囊胚106枚,结果显示配种后7~9 d胚胎的发育阶段适宜于分离内细胞团(ICM)。细胞毒性试验表明,抗血清对关中奶山羊红细胞、囊胚和波尔山羊囊胚均具有细胞毒性作用。通过比较抗血清50%溶解山羊红细胞效价与溶解囊胚滋养层细胞效价的差异,发现后者的适宜效价是抗血清50%溶解山羊红细胞效价的22~23倍,表明采用易于获得的山羊红细胞作预试验可以为免疫外科分离山羊ICM提供抗血清稀释比例参考。免疫外科法分离ICM采用两步法进行,获得最佳参数如下:抗血清稀释比例为1∶4~1∶15,补体稀释比例为1∶20,先在抗血清中作用30 min,再在补体中作用20~30 min,吹打除去溶解的滋养层细胞后即可获得ICM。分离得到的ICM形态特征与胚胎质量密切相关。山羊ICM接种于丝裂霉素处理过的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层后,2 d内贴壁。4~7 d后,ICM增殖为胚胎干细胞样集落,其周围出现大量空泡样细胞。     

E-钙粘蛋白抗体对小鼠早期胚胎发育的影响

旨在研究E-钙粘蛋白抗体(ECCD-1)对小鼠早期胚胎体内外发育的影响.在体外培养小鼠8-细胞胚胎的培养液中,分别添加不同浓度的ECCD-1,通过胚胎形态观察、碱性磷酸酶染色、多能性因子免疫染色、体外贴壁培养、嵌合体制备以及体内移植试验检测ECCD-1对小鼠胚胎发育能力的影响.结果表明,ECCD-1抗体延迟胚胎致密化和囊胚腔形成,但内细胞团并未受到影响,胚胎碱性磷酸酶和SSEA-1、Oct-4、Sox2、Nanog 4种多能性因子的免疫染色都呈阳性,此外,ECCD-1抗体也不影响胚胎的体外贴壁生长、体内移植着床以及嵌合体的制备.这些数据表明,ECCD-1抗体延迟胚胎致密化但并不影响胚胎的体内外发育能力.     

逆转录病毒载体介导的蜘蛛拖丝蛋白转基因小鼠的制备

为了建立通过转基因动物获得蜘蛛拖丝蛋白的方法,试验利用前期构建的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)逆转录病毒载体侵染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),通过嵌合体法制备转基因小鼠,并用PCR技术进行鉴定。结果表明:成功获得嵌合体小鼠;目的基因2S-IRES-EGFP已整合入F0代及F1代嵌合体小鼠的鼠尾基因组中。说明利用逆转录病毒可成功获得表达蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)的转基因小鼠。     

由体外受精囊胚获得ICR小鼠ES细胞

收集鼠卵母细胞和精子，采用体外受精技术，获得早期胚胎。体外培养胚胎至囊胚，分离内细胞团，获得ICR小鼠的ES细胞。结果不但获得了来自体外受精囊胚的ICR小鼠ES细胞，而且表明用体外受精方法获得的小鼠早期胚胎的数量明显大于常规方法，且比较稳定。ICR小鼠ES细胞的获得，为研究小鼠的ES细胞分化提供了条件。     

水平显微注射法制备转基因小鼠的研究

由于传统显微注射法具有操作繁琐、技术要求高和外源基因导入率低等局限性,本试验对常规显微注射法进行改进,旨在建立一套比较完善的水平显微注射方法。采用水平微注射系统,将外源DNA片段导入胚胎的雄原核中,获得子代鼠,分娩后3周提取鼠尾基因组DNA,PCR法筛选转基因阳性鼠。本试验采用Puc/BLG IN S和Chym os in基因,共使用710枚鼠原核胚进行研究,胚胎经注射后移植了25只受体,产下仔鼠77只;妊娠率分别为33.3%(5/15)和50%(5/10),胚胎成活率分别为9.47%(41/433)和l3.00%(36/277),阳性率分别为4.88%(2/41)和8.33%(3/36)。将阳性雌鼠配种妊娠后,对外源基因整合情况进行检测,结果表明初步获得了转基因阳性小鼠。     

转sMTPPGH基因小鼠胚胎的体外培养

采用纯化的羊金属硫蛋白（sMT)启动子指导的猪生长激素（PGH)基因(sMTPGH)为显微注射片段，将其导入小鼠受精卵原核，比较了几种不同培养液对导入外源基因的小鼠胚胎体外发育的影响。结果表明，改进的M16培养液（用mM16表示）能有效克服2－细胞阻断现象，并使转基因胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在mM16培养液的基础上，再加入表皮生长因子（EGF），可使1－细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在3和培养液（M16,mM16,mM16 EGF)中，转基因胚胎突破2－细胞阻断期的比率分别为12％，68％，90％，发育到囊胚期的比率分别是0％，20％，43％。采用PCR方法检测57枚经体外培养发育至囊胚的显微注射胚胎，4枚扩增出阳性条带，外源基因在囊胚期胚胎的滞留率为7％。     

小鼠胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代研究

对影响小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES细胞）培养、克隆、分离、传代效果的因素进行了探索研究。应用223枚昆明白小鼠胚胎和20枚129品系小鼠胚胎的研究结果表明，129品系小鼠胚胎比昆明白小鼠胚胎更适合作为ES细胞建系的材料，两者FS出现率差异显著（P＜0．05）；以DMEM＋10％NBS＋10％FCS为基础培养液，分别加入LIF、胰岛素、LIF＋SCF，极显著提高昆明白小鼠胚胎贴壁率，ICM生长率及F1、F2出现率（P＜0．01），而在DMEM＋10％NBS＋10％FCS＋LIF＋SCF为培养液，得到昆明白小鼠胚胎最高贴壁率、ICM生长率及传代率；4dpc胚胎传代情况显著好于3．5dpc胚胎（P＜0．05）。     

小鼠皮肤成纤维细胞的体细胞核移植

取成年小鼠唇部皮肤进行培养，分离成纤维细胞并血清饥饿培养1周，用作核供体。对成年小鼠进行超排，取卵母细胞用作核受体，核移植重构胚经SrCl2激活处理6h后，同mM16培养液和小鼠输卵管上皮细胞共培养，把发育到早期囊胚的重构胚转移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加ES细胞条件培养液，消化分离ICM，然后接种培养，对孵出的ES细胞样集落进行鉴定培养。结果显示，小鼠唇部皮肤成纤维细胞为核供体，核移植重构胚2-细胞率为54．05％，桑椹胚率17．14％，囊胚率6．90％，对照组卵丘细胞的核移植重构胚2-细胞率为60．00％，桑椹胚率21．85％，囊胚率11．69％，但2种供体细胞在支持核移植重构胚发育能力上差异不显著。成纤维细胞重构囊胚中6个囊胚分离出ES细胞样集落，3个ES细胞样集落可稳定传代；对照组卵丘细胞重构囊胚中9个囊胚中分离出ES细胞样集落，5个ES细胞样集落可稳定传代。从核移植重构胚中分离出的ES细胞样集落具有岛状或巢状群体生长形态，生长旺盛的集落可自发分化成单个散在或片状存在的上皮样或梭形细胞，碱性磷酸酶检测为阳性，常规冻存复苏，仍显示ES细胞特征。     

胚胎干细胞及种系嵌合体的研究进展

胚胎干细胞是着床前的囊胚内细胞团或早期胎儿的原始生殖细胞经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系 ,具有与胚胎细胞相似的形态特征和分化潜能 ,体外培养时保持未分化状态 ,可以传代增殖。改变维持胚胎干细胞不分化的培养条件 ,胚胎干细胞可自发分化成多细胞结构。在一定诱导下 ,胚胎干细胞可向多个方向分化 ,并生成多种功能细胞。胚胎干细胞注入到胚泡期胚胎或与桑椹期胚胎聚合 ,可以参与包括性腺在内的各种组织的嵌合体的形成。胚胎干细胞在细胞分化与调控 ,胚胎发育 ,遗传病 ,肿瘤 ,免疫和组织或器官移植等研究中显示着广泛的应用前景。而种系嵌合体的获得是实现 ES细胞途径的决定步骤 ,低的种系嵌合率则是制约 ES细胞应用的关键。提高供体 PGCs在受体生殖腺中的比例 ,缩短 ES细胞的体外培养时间 ,以及注入早期发育阶段的受体胚胎等都能提高种系嵌合率。文章从多个方面综述了胚胎干细胞的最新研究成果 ,并着重以禽类 ES细胞为例论述了种系嵌合体的检测方法 ,种系嵌合率的影响因素以及提高种系嵌合率的方法     

山羊类ES细胞的分离与克隆

采集山羊交配后6～8d的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚,将桑椹胚和囊胚分别放在小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层和同源原代胎儿成纤维细胞(PGEF)饲养层上比较其脱带时间及脱带率。脱带后,将各自一半胚胎切割,把含ICM的半胚分别放在相应饲养层上进行培养,另一半整胚在各自饲养层上继续培养,而孵化囊胚直接于PGEF饲养层上培养。当ICM增殖一定程度时进行传代,以比较其类ES细胞分离与克隆的效果。结果表明,在2种不同饲养层上,囊胚的脱带时间均短于桑椹胚,囊胚的脱带率均高于桑椹胚,而饲养层的种类对胚胎的脱带时间以及脱带率影响不大。脱带切割囊胚不论在PMEF还是在PGEF饲养层上,其贴壁时间均短于脱带整胚及孵化囊胚,而贴壁率高于脱带整胚,与孵化囊胚相似。脱带整胚及脱带切割胚在PMEF饲养层上所获类ES细胞只能维持3代,而在PGEF饲养层上,脱带切割半胚和孵化囊胚所获类ES细胞传至5代。由此认为,对脱带后的胚胎进行切割处理,有利于ICM的贴壁和增殖;应用同源原代胎儿成纤维细胞饲养层培养系统,有利于类ES细胞的分离与克隆。     

In vitro development of mouse pronuclear embryos to blastocysts in sequential media with and without co-culture of autologous cumulus cells

The objective of this study was to use mouse embryos as a model system to investigate the effect of co-culture of cumulus cells in Sydney IVF sequential media (Cook) on embryo development, based on the hypothesis that feeder cells in co-culture with a sequential medium could work synergistically to further improve in vitro culture conditions for mammalian preimplantation embryos. The culture systems described here were evaluated by the ability to consistently produce high blastocyst formation rates and high cell number per blastocyst. The role of embryo-to-cell contact was assessed by using Transwell inserts with transparent microporous membranes. Pronuclear embryos of ICR mice were cultured to blastocysts in Cook sequential media, with and without mouse primary cultures of cumulus cells, and with or without inserts. Blastocyst formation rates and cell numbers of in vitro developing embryos in the different culture systems were compared to each other, and to in vivo derived blastocysts. Blastocyst formation rates for Cook medium only was 27.8% (without inserts) and 32.9% (with inserts), whereas Cook-Cumulus cells in identical culture systems was significantly higher at 45.8% (without inserts, P<0.05) and 55.6% (with inserts, P<0.05). When the embryos are suspended above the bottom of the well, for Cook medium significantly lower blastocyst formation rates were observed at 4.2% compared to Cook-Cumulus cells at 17.5% (P<0.05). Mean cell numbers of blastocysts obtained in all co-culture systems were significantly higher (P<0.05) compared to those developing in culture medium only. Although the putative mechanism is as yet unexplained, the improved blastocyst formation rates and cell numbers in co-culture when there is direct contact between the embryo and the cell monolayer suggest that the close proximity between the feeder cells and embryos is in part responsible for these effects.     

昆明系小鼠胚胎干细胞分离培养的优化

以昆明系小鼠为对象,经过丝裂霉C处理成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)制备饲养层,对影响小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)分离培养的相关因素进行研究。分别收集小鼠3.5d的囊胚(扩张囊胚)和4.5d囊胚(孵化囊胚)进行培养,比较扩张囊胚和孵化囊胚的贴壁率、原代克隆率及传代率的情况。收集3.5d胚龄的囊胚,通过全胚法和免疫外科法对内细胞团(Inner cell mass,ICM)进行分离培养ICM集落,确定离散ICM的适宜时间。用0.25%胰酶+0.04%EDTA,0.125%胰酶+0.02%EDTA和0.25%胰酶+1%小鸡血清等方法对小鼠ES细胞集落进行传代,观察不同酶浓度对ES细胞分离克隆的影响。结果显示,孵化囊胚的贴壁率高于扩张囊胚(P0.05),但传代率则相反(P0.05),原代克隆率差异不显著(P0.05);一般ICM增殖培养2～3d(免疫外科法)或4～5d(全胚培养法)后,出现典型的克隆集落,再挑取ICM;0.125%胰酶+0.02%EDTA及0.25%胰酶+1%小鸡血清,形成ES原代克隆率较高,2组没有显著性差异(P0.05);结果表明,分离得到的ES细胞经形态学观察,AKP染色,体外分化试验等表明其具有胚胎干细胞的特性。     

ICR小鼠胚胎干细胞建系初步研究

实验旨在探讨消化方式和胚胎发育阶段对ICR小鼠胚胎干细胞(ES细胞)建系效率的影响。ICR小鼠3.5 d囊胚在饲养层上贴壁后采用单一酶消化或机械化与酶消化法相结合分离隆起的细胞集落,进行传代培养;然后选择二者中较优消化方式对不同发育时期囊胚所形成的细胞集落进行处理。结果表明:采用机械化与胰酶消化相结合的方式,形成的类ES细胞超过7代的比率(85.0%)要显著高于单一的胰酶消化(15.0%)(P<0.05);当用二者相结合的方式对ICR小鼠3.5 d(早期囊胚)、4.0 d(扩张囊胚)和4.5 d(孵化囊胚)所形成的细胞集落进行消化传代培养,三者在贴壁率和形成原代细胞集落率上均无显著差别(P>0.05),但传代超过7代的效率上早期囊胚和扩张囊胚均高于孵化囊胚(P<0.05)。结果提示,采用机械化与酶消化法相结合更适合于3.5～4.0 d ICR小鼠囊胚的ES细胞建系。     

OPS玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响

为探究开放式拉长细管(OPS)玻璃化冷冻对四倍体胚胎发育的影响,本实验利用2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,再对四倍体胚胎进行OPS玻璃化冷冻,分别观察记录二倍体胚胎、四倍体胚胎以及冷冻解冻后四倍体胚胎的发育情况。结果表明:2-细胞胚胎电融合效率为96.1%;二倍体胚胎组与电融合后四倍体胚胎组的囊胚率和孵化囊胚率差异不显著;冷冻解冻后四倍体胚胎的囊胚率(100%)与四倍体新鲜组(93.3%)差异不显著,其孵化囊胚率(72.3%)较新鲜组(64.9%)显著增高(P<0.05);四倍体冷冻解冻组的囊胚细胞数(31.96)与新鲜组(32.54)无显著差异;冷冻解冻后的四倍体早期囊胚进行体外培养时其发育速度比对照组更快。可见,冷冻对小鼠四倍体胚胎的囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响,但孵化囊胚率显著提高,且OPS玻璃化冷冻后使四倍体胚胎的发育速度更快。     

Generation of Buffalo (Bubalus bubalis) Transgenic Chimeric and Nuclear Transfer Embryos Using Embryonic Germ-Like Cells Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein

The possibility of producing transgenic buffalo embryos by chimera and nuclear transfer (NT) using buffalo embryonic germ (EG)‐like cells expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) has been explored in this study. Buffalo EG‐like cells and fibroblasts with two to eight passages were transfected with the lined plasmid (pCE‐EGFP‐IRES‐Neo‐dNdB) using Lipofectamine^TM 2000 and selected by culturing in 200 μg/ml G418 for 6–8 days. G418 resistant fibroblasts and EG‐like cells were used for embryo chimera and NT. To produce blastocysts by chimera, 8–16 cells embryos were injected with EG‐like and fibroblast cells. Then, to produce blastocysts by NT, in vitro maturated oocytes were enucleated and afterwards EG‐like/fibroblast cells transferred into the perivitelline space. No statistical differences were observed for the total blastocyst produced by the chimeric method, using EG‐like and fibroblasts as donor cells, resulting on an accomplishment of 35.6% vs 33.3%, respectively. Nevertheless, besides from the 37 blastocysts produced, 23 (62.2%) from EG‐like cells expressed EGFP, none of blastocysts from foetal fibroblasts expressed this protein. When the NT method was used, no statistical difference among different generations was observed in the percentage of oocytes fused, cleaved, and developed to blastocysts after NT for EG‐like cells. On average, the percentage of oocytes fused, cleaved, and developed to blastocysts after NT was respectively 81.8%, 67.7% and 10.7%. For the expression of EGFP, from the 12 blastocysts produced by NT, 7 of them were positive, while none of NT embryos from EGFP positive fibroblasts developed to blastocysts. Results of the present study clearly demonstrated that gene transfected buffalo EG‐like cells have the ability to form chimeric embryos after injecting into buffalo early embryos and reprogramming ability after NT, which can be employed to produce transgenic buffalos through either embryo chimera or NT.     

Nanog基因的生物学功能研究进展

胚胎干细胞具有无限增殖能力和多向分化潜能决定了它在医学及生物学基础研究中具有巨大的应用潜力。探索维持胚胎干细胞特性的分子机制成为胚胎干细胞的生物学研究中的热点。研究发现与维持胚胎干细胞多能性相关的基因有Oct4、Nanog、Sox2等，其中Nanog是2003年5月末发现的一个基因，它对维持胚胎干细胞多能性起关键性作用，能够独立于L1F/Stats维持ICM和ES细胞的多能性。几年来，Nanog的生物学功能及其与Oct4、Sox2等多能性维持基因之间的相互作用关系已有较为深入的研究。作者在综述Nanog基因的表达特征和功能的基础上，重点探讨Nanog基因表达调控以及Oct4、Sox2等多能性维持基因之间的相互作用关系，并展望其应用前景。     

自噬调节因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育过程中的表达分析

旨在探究自噬调节因子Atg5和Beclin1在胚胎早期发育过程中的表达模式及胚胎的不同生产方式对两种因子表达的影响。本研究将6~8周龄雌性小鼠进行超数排卵,分为2组,一组收集小鼠卵母细胞,孤雌激活处理后进行体外培养;另一组超排小鼠与公鼠1：1合笼,第2天收集小鼠受精卵进行体外培养;分别在2细胞期、4~8细胞期、桑葚胚期和囊胚期收集不同阶段小鼠孤雌激活胚胎和自然受精胚胎。提取RNA和蛋白,通过实时荧光定量PCR、Western blot等方法检测自噬关键因子Atg5和Beclin1的表达,通过间接免疫荧光法检测Atg5和Beclin1在小鼠囊胚中的表达定位。结果显示,小鼠自然受精和孤雌激活胚胎在发育各时期均可表达Atg5和Beclin1,表达量在胚胎发育的早期呈现出较高的水平,其中二者的表达在小鼠自然受精胚胎中从2细胞期起逐渐降低,而在孤雌激活胚胎的4~8细胞阶段表达量最高,与同期自然受精胚胎差异极显著（P<0.01）;从4细胞期开始,各时期孤雌激活胚胎中Atg5和Beclin1蛋白表达水平均高于自然受精胚胎,差异极显著（P<0.01）;在囊胚中,滋养层细胞和内细胞团中均可检测到Atg5和Beclin1蛋白的荧光,但内细胞团中的荧光强度高于滋养层细胞,且Beclin1蛋白在孤雌激活胚胎囊胚内细胞团中荧光强度高于自然受精胚胎。自噬关键因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育各时期均有不同程度的表达,提示自噬对早期胚胎发育的调控作用与胚胎的生产方式存在一定关联,研究结果为进一步探索细胞自噬参与哺乳动物胚胎发育的生理调控提供理论依据。