一步法扩增IBDV上海株全长基因组cDNA

为了研究鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）上海株的全部核苷酸序列，应用蛋白酶K消化、割胶纯化获得了高纯度的dsRNA，应用随机引物合成了cDNA的第一链。参照基因库中相关IBDV毒株的基因序列，设计合成了两对引物，一步扩增出IBDV上海株全长基因组cDNA的A片段和B片段。为了验证获得的A片段和B片段的正确性，以扩增出的A片段为模板，成功扩增出的IBDV的VP2基因，并应用T载体进行了克隆和测序，测序结果显示，其与国内外数株IBDV毒株的同源性很高，表明醉建立的扩增IBDV全长基因组cDNA的一步法正确、可行。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK—／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5．9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于PUC18铁KpnI位点，然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHi位点，构建转移质粒pUEKPZ，该将质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待完全病变后在X－gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增，Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ 突变株。     

鸡传染性法氏囊病病毒(ZJ2000)基因组B节段全长的克隆及其毒力位点的分析预测

将本实验室保存的ZJ2000株囊毒加生理盐水研磨后接种9～10日龄鸡胚增殖病毒，收集尿囊液透析纯化，用蛋白酶K法提取病毒基因组dsRNA。通过RT-PCR获得基因组B节段全长的eDNA。并将其克隆到PUC18-T载体中进行测序。同时，本研究对GenBank中登录的IBDV基因组B节段进行了大量分析，发现B节段的5＇-NCR存在1个基因高突变区，并且ZJ2000株的5＇-NCR可形成独特的二级结构。经过对VP1一级结构的大量分析，筛选出B节段中17个可能对IBDV毒力产生影响的候选毒力位点，并在此基础上又对这些位点氨基酸的特性进行统计分析，进一步探讨了这些位点对VP1功能影响的可能性，为深入研究IBDV基因组B节段对其毒力的影响作了有益的探索。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻（BVD）鉴别诊断ELISA方法，采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段，分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上，获得了重组质粒pGEX-6PI-p80A、pGEX-6PI-p80B和pGEX-6P1-p80C，将其分别转化感受态茵Rosetta和BL21，经1．0mmol／L的IPTG诱导，分别得到大小为60、47和51ku的目的蛋白。经Western-blotting分析，3个目的蛋白中，只有p80B（289～477aa）基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应，表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

基于DNA-launched的猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作系统的建立

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,将PRRSV全基因组分6段克隆,构建获得6个重组质粒,先由A1和A2片段或B1和B2片段连接构成A片段或B片段,然后D、C、B和A片段依次亚克隆入pOKq载体。在基因组5′端和3′端分别加上CMV启动子序列和BGH终止信号肽,全基因组510位核苷酸突变引入遗传标记位点FseⅠ。测序正确的全基因组质粒命名为pOK-A2BCD。再将pOK-A2BCD质粒转染BHK-21细胞,拯救病毒通过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,结果表明拯救病毒成功,为进一步研究PRRSV致病性等相关分子机制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株F9811VP_2基因的克隆及序列分析

根据 NCBIG Gene Bank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒 ( vv IBDV) OKYM株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增 IBDV主要宿主保护性抗原 VP2 基因的引物。从 IBDV F981 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒 RNA,经 RT-PCR扩增出约 1 .5kb的基因片段 ,采用平端连接法将此基因片段克隆至p UC1 1 9质粒的 Sma 位点上。经核苷酸序列测定 ,并与国内外其他 vv IBDV VP2 基因序列进行比较分析 ,发现 F981 1与 OKYM在 VP2 基因上有 1 8个核苷酸不同 ,但在氨基酸序列上仅 2 1 2位存在差异 ,从而从分子生物学角度证明 F981 1为 vv IBDV。对 1 4 3～ 3 82氨基酸区域所作系统进化树分析表明 ,F981 1、G92 0 1与OKYM、UK661、HK4 6相近 ,而 F950 2、G93 0 3与 OKYM、U K661、HK4 6较远 ,说明我国存在许多不同的vv IBDV毒株     

鸡传染性法氏囊病TL株VP2基因克隆及部分特性分析

传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus IBDV）是引起禽免疫抑制性疾病的一种主要病原体，属于双链RNA病毒科，禽双节段RNA病毒属成员。其基因组由两个节段dsRNA（A、B）构成，大片段A长约3．4kb，编码一条多聚蛋白，该蛋白随后裂解为VP2、VP3和VP4。小片段B长约为2．9kb，编码VP1。其中VP2携带宿主保护性抗原决定簇，具有至少两到三个中和性抗原位点，可以诱导产生保护性中和抗体，并且有血清型特异性。Ⅰ型IBDV毒株的VP2cDNA核苷酸及相应氨基酸残基序列中，共同存在着一个高度可变区（AccⅠ～SpeⅠ）含有两个亲水区和一个七肽区。     

伪狂犬病病毒鄂A株 TK－／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI／KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5.9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于pUC18的KpnI位点。然后进一步克隆其中含TK基因的PstI／KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHI位点，构建转移质粒pUEKPZ。将该质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK-15细胞，待完全病变后在X-gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增、Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK     

LA-PCR快速克隆传染性法氏囊病病毒基因组A节段全长cDNA方法的建立

从浙江省某鸡场暴发疑似传染性法氏囊病 (IBD)的法氏囊病料中分离到 1株致死率高达 70 %的强毒株 (IBDV-ZJ2 0 0 0 )。通过筛选 ,采用效果最理想的蛋白酶 K法从法氏囊中提取病毒基因组 RNA,经 L i Cl纯化后 ,优化各种反应参数和条件 ,建立了 L ong- accurate PCR(L A- PCR)一步直接扩增 IBDV A节段全长 c DNA的方法 ,得到一约 3.2 6 kb的片段。L A- PCR法能快速从病鸡法氏囊和细胞适应毒中扩增 A节段全长 c DNA,为研究各 IBDV毒株 A节段的结构和功能打下了基础。     

家鸡Leptin成熟肽cDNA的克隆、重组蛋白表达及纯化

从 18周龄鸡卵巢组织中抽提总 RNA,使用六聚体随机引物反转录后 ,用鸡 L eptin(瘦素 )特异性引物扩增出鸡L eptin编码区第 5 2～ 4 6 0 bp的长度为 4 0 9bp的 c DNA片段。根据鸡 L eptin的 3′端第 4 6 0～ 4 92 bp序列设计了 3条部分相互重叠并且顺序串联延伸的下游反义引物 ,并在最后 1条引物 3′端连接上 Eco R 切点 ;在以上用于反转录扩增的 5′端引物的 5′端连接一 Bam H 切点。用该 5′端引物分别与 3个 3′端引物配对 ,利用反转录扩增出的 4 0 9bp的L eptin c DNA片段作为第 1模板进行扩增 ,扩增产物再作为模板与下一引物对再次扩增。经 3次扩增得到编码鸡 L ep-tin成熟肽的全长 4 5 1bp的 c DNA序列。将该 4 5 1bp的 L eptin c DNA序列经 Bam H 和 Eco R 双酶切后 ,克隆入表达质粒 p RSET A的 Bam H 和 Eco R 两酶切位点之间 ,构建成表达质粒 p L ep- SCAU。转化有重组表达质粒 p L ep-SCAU的大肠杆菌 BL 2 1(DE3)在 L B培养基中培养后 ,经 IPTG诱导表达出相对分子质量为 2 0 10 0的鸡 L eptin融合蛋白和少量 4 0 2 0 0的 L eptin融合蛋白。L eptin融合蛋白的表达在 IPTG浓度为 0 .0 5 mmol/ L 时达到最高 ,占总菌体蛋白的 32 .6 %。用 Ni- NTA凝胶从 7L 发酵培养菌裂解液中纯化出 180 m g左右     

猪伪狂犬病毒PCR检测方法的建立及应用

根据猪伪狂犬病毒（PRV）gE基因序列保守区段,设计一对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬病毒野毒株与基因缺失疫苗株的PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果显示,该PCR方法可扩增出388 bp的目的片段;对模板的最低检测量为1.1 pg;与猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪支原体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应,具有高特异性。采用建立的PCR方法对2014年以来全国不同地区81个猪场421份疑似病料进行检测,发现PRV猪场平均阳性率为35.80%,样品平均阳性率为 25.42%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

将200003批疫苗免疫4周龄SPF鸡,免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180和225 d分别采血,分离血清,采用ELISA方法检测血清抗FPV抗体,结果表明重组疫苗免疫后14 d,免疫鸡血清抗体已经全部阳转,免疫后的21 d血清抗FPV的抗体出现峰值,此后便开始下降,到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平.用ILTV WG株和FPV 102株强毒进行的攻毒保护试验与血清检测的结果基本一致,在免疫后的5个月内可以使免疫鸡获得100%(10/10)保护,免疫后的6个月对ILT和FP的免疫保护分别为1/7和2/10,此时需要对鸡群实施二次免疫.其他5批疫苗(200001、200002、200101、200102和200103)免疫SPF鸡后5个月用ILTV WG株和FPV 102株攻击也获得了完全保护.     

鸭源流感病毒人工感染鸡的病毒抗原定位动态

研究了由南京地区分离的鸭源流感病毒A/duck/Nanjing/21/95（H9N2？）感染商品来航鸡后，各组织脏器中病毒分离情况和病毒抗原分布。结果表明，禽流感病毒（AIV）可以从肾脏、肺脏、脾脏和心脏中分离出来，接种后3d(PI3），病毒在组织中的分离率最高，且又以肾脏的分离率最高。病毒抗原主要分布在肾小管上皮细胞、呼吸系统单核细胞和少量上皮细胞的胞核内，PI3时病毒抗原的检出率最高。这些结果表明，肾脏是该毒株复制的主要部位，肾脏的病变是病毒直接损伤的结果，而且该株AIV具备在呼吸系统内复制的潜力。     

鸡痘母源抗体对重组鸡痘疫苗免疫效果的影响

为了检测抗鸡痘病毒母源抗体对喉气管炎重组鸡痘疫苗的影响,孵化一批来自禽痘病毒高免母鸡的雏鸡,采用ELISA方法检测鸡痘疫苗免疫鸡后代的血清抗体。检测结果表明,雏鸡自孵出2d开始,血清鸡痘病毒抗体水平就开始缓慢下降,到15日龄时下降至临界值,已有部分鸡开始出现抗体阴性反应;到21日龄时,全部被检血清抗体水平均转为阴性。分别于不同日龄对试验雏鸡免疫接种重组鸡痘疫苗,结果只有当鸡体内的鸡痘病毒母源抗体全部为阴性(21日龄)后免疫时才能产生可靠的保护作用,保护率达到80％以上。这说明鸡痘病毒母源抗体对重组鸡痘疫苗的效果有一定的影响,因此重组疫苗合理的首免时间应选择在3周龄以后。     

5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103.该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段.     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

用表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒（rFPV～gB—F）制备的疫苗免疫4周龄SPF鸡，免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180d分别采血，分离血清，检测抗FPV和gB的抗体。结果表明重组疫苗免疫后14d，免疫鸡血清抗体已经全部阳转，免疫后的21d血清抗FPV的抗体出现峰值；此后便开始回落，到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。抗gB的抗体在免疫后的第二周达到阳性，之后的六个月都为阳性。在免疫后的每个月将免疫鸡取20只再分成两组。分别用新城疫强毒与传染性喉气管炎强毒的攻击。在免疫后的第一个月对新城疫的保护率为8／10，第2个月对新城疫的保护为7／10，第3个月为2／10，因此对新城疫的免疫保护期为2个月。在免疫后的5个月内可以使免疫鸡对传染性喉气管炎强毒攻击的保护率达到8／10以上，免疫后的6个月对ILT为8／13．因此rF—PV-gB—F对传染性喉气管炎的免疫保护期为5个月。     

表达新城疫HN和F基因重组禽痘病毒的免疫效力测定

将8日龄SPF鸡随机分组.分别接种rFPVHN、rFPVF、rFPVNHF重组禽痘病毒,接种量为每只鸡105PFU,另一组群用La Sota活苗经点眼、滴鼻接种10<'6>EID<,50>.于免疫后6d、12d和18d测定HI和微量中和抗体.结果发现,3种重组病毒均能刺激鸡群产生抗新城疫病毒特异抗体,但抗体产生时间比La Sota活苗缓慢,且抗体滴度亦低.然而共表达HN和F的rFPVNHF免疫鸡群的中和抗体水平明显比rFPVHN和rFPVF组群高.表明rFPVNHF的保护性免疫更优于HN或F单基因重组禽痘病毒.     

甘肃省张掖地区苜蓿花叶病病原的检测

2011年7月在甘肃省张掖地区发现发生花叶病的苜蓿田块,地块中病株呈现黄斑花叶、叶柄扭曲及整株矮化的症状。为明确其病原,采集病株后利用血清学和分子生物学方法对病样进行了检测。 DAS-ELISA、RT-PCR-RFLP及病毒CP基因序列测定分析结果表明,苜蓿病样受到番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)和苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)的复合侵染。这是国际上首次报道番茄花叶病毒对苜蓿的侵染,讨论了由这两种病毒引致病害的发生与防治。     

内蒙地区兔病毒性出血症病毒分离鉴定

从内蒙古武川县分离出2株兔出血症病毒，分别命名为RHD-NW1毒株和RHD-NW2毒株，对其进行了形态、理化及生物学特性研究。结果表明，2株病毒在兔体连续传4代均出现典型免病毒性出血症症状和病理变化，是毒力稳定的强毒株。病毒粒子在电镜下呈球形，直径30nm左右，无囊膜，有实心和空心2种病毒粒子。2株病毒对热(56℃6min)、酸（pH3)、乙醚和胰蛋白酶不敏感，对人的O、B型红细胞有高度凝集性。     

环状病毒的流行与传播

环状病毒是牲畜常见的重要病原体,主要包括有蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒、马器质性脑病病毒和流行性出血热病毒等。这些病毒能够通过吸血性的库蠓传播。本文主要介绍了这几种病毒在世界各地的流行与传播情况。