奶牛bTAP蛋白表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

奶牛气管抗菌肽是一种具有较强抗菌活性的抗菌小肽。实验从奶牛气管组织中提取总RNA,反转录成c DNA,以此为模板,用奶牛气管抗菌肽特异性PCR引物扩增奶牛气管抗菌肽基因,然后将其连入载体p CMV-C-e GFP中构建奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用荧光蛋白观察和细菌记数等方法检测b TAP-GFP蛋白在细胞中的表达及其对大肠杆菌的抗菌活性。试验结果表明,试验成功的建立了奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗大肠杆菌活性的b TAP-GFP蛋白。     

奶牛乳铁蛋白肽真核表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

实验用奶牛乳铁蛋白肽特异性PCR引物从奶牛乳腺组织中扩增奶牛乳铁蛋白肽基因,然后将其连入pCMV-N-eGFP载体中,构建奶牛乳铁蛋白肽的真核表达载体GFP-LfcinB,并将其转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用蛋白质免疫印记和牛津杯法等方法检测GFP-LfcinB蛋白在细胞中的表达及其对金黄色葡萄球菌的抗菌活性.结果表明,试验成功的建立了奶牛乳铁蛋白肽的真核表达载体GFP-LfcinB,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗金黄色葡萄球菌活性的GFP-LfcinB蛋白.     

脾源性酪氨酸激酶基因在奶牛乳腺中的表达研究

为探讨脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)的表达与奶牛乳腺发育和泌乳功能之间的关系,试验采用Western blotting和激光共聚焦显微技术对泌乳期高乳品质、低乳品质及干乳期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织中SYK的表达含量和表达部位的变化进行研究。结果表明,干乳期奶牛乳腺组织中SYK的表达显著高于泌乳期奶牛乳腺组织(P<0.05),泌乳期高乳品质、低乳品质奶牛乳腺组织中SYK的表达差异不显著(P>0.05);在干乳期SYK主要在乳腺导管上皮细胞的胞质中表达,而在泌乳期SYK在腺泡上皮细胞中表达。结果提示SYK是乳腺上皮细胞增殖与分化的调节因子,主要参与干乳期乳腺组织的重建过程。     

夏季奶牛血液中热休克蛋白的表达量

选择40头体质健康的中国荷斯坦奶牛,根据胎次和泌乳天数,按照随机区组试验设计分为Ⅰ组（30kg/d）、Ⅱ组（30～35kg/d）、Ⅲ组（35～40kg/d）和Ⅳ组（40kg/d）。热应激前、热应激前期、热应激中期、热应激后期和热应激后分别于尾静脉采血,用ELISA试剂盒测定热休克蛋白（HSP）27,70,90的表达量。结果显示,Ⅳ组HSP27表达量最高,Ⅱ组表达量最低,Ⅳ组、Ⅲ组和Ⅰ组均显著高于Ⅱ组（P〈0.05）。HSP70表达量各组间没有明显差异,但随产奶量呈线性增加（P〈0.05）。HSP90的表达量,Ⅳ组和Ⅲ组明显高于Ⅱ组（P〈0.05）。HSP27的表达量热应激后差异较大;HSP70的表达量各组整个过程差异较大;HSP90的表达量在热应激前、热应激前期和热应激后差异较大。总之,在热应激过程,高产奶牛血清中热应激蛋白的表达量较高,HSP70表达量随产奶量呈线性增加,而不同热应激蛋白的变化规律差异较大。     

奶牛骨钙素基因的克隆与原核表达

以奶牛骨组织提取的RNA为模板，利用RT—PCR技术扩增出奶牛骨钙素全长cDNA，然后将扩增产物重组到PMD-18T载体中，测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明，奶牛骨钙素全长cDNA为303bp，编码100个氨基酸，与GenBank中的X53699的序列完全相同。通过加端PCR技术连接单链DNA片段人工定点同义突变，将奶牛骨钙素成熟蛋白基因中的大肠杆菌稀有密码子同义突变为大肠杆菌常用密码子并亚克隆至PET-32a表达载体．转化到宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，成功表达出奶牛骨钙素融合蛋白。     

不孕症奶牛血液中微量元素碘含量的测定

本试验采用催化滴定法测定了不孕症奶牛与正常奶牛血液中微量元素碘的含量,结果显示：不孕症奶牛血液中微量元素碘的含量明显低于正常牛,为不孕症的发生和治疗机理的探讨提供参考。     

基于外周血液中基因差异表达分析的奶牛早期妊娠诊断

奶牛的早期妊娠诊断在实际生产过程中具有重要的意义,但是现有的妊娠诊断技术因存在诸多弊端而很少能够在生产中应用和推广。妊娠识别阶段某些关键基因在外周血液中显著差异表达规律为我们探索新的早期妊娠诊断技术提供了契机。本文对奶牛妊娠诊断的研究进展进行了简要阐述,提出了通过分析外周血液中关键基因的表达情况对奶牛进行早期妊娠诊断的方法,并着重就其基本原理、应用前景以及存在的问题进行了阐述。     

重组奶牛干扰素-α基因的原核表达

从健康奶牛的血液中分离白细胞，用刺激物诱导白细胞产生干扰素，采用RT—PCR扩增干扰素-α基因，构建原核表达载体pQE30-IFNα，用IPTG诱导表达。得到重组的奶牛成熟干扰素-α基因全长498bp，构建的原核表达载体诱导6h后表达量较高，表达产物的分子量约为20kD，从而获得了表达奶牛干扰素-α的基因工程菌株。     

恩诺沙星在奶牛血液和乳中药物浓度的监测

对 5头患有子宫内膜炎的奶牛经子宫灌注含恩诺沙星的复方制剂 10 0mL ,并于给药 0 ,0 .5 ,1,2 ,4 ,8,12 ,2 4h后 ,用高效液相色谱法为定量手段 ,利用荧光检测器分别测定复方制剂中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的血药、乳药浓度。结果表明 ,恩诺沙星给药后 2h左右在血中浓度达到最高值 ,然后逐渐下降。至 8h在血浆中的药物浓度为 (0 .6 4± 0 .16 ) μg/mL。 12h后检测不到恩诺沙星。而代谢产物环丙沙星于给药后 4h血药浓度可达最高峰 ,至 12h血药浓度为 (0 .0 5± 0 .0 1) μg/mL ,2 4h已检测不到。对于乳药浓度 ,恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星皆于给药后 4h ,浓度达到最高峰 ,分别为 (1.6 9± 0 .30 ) μg/mL和 (0 .4 9± 0 .12 ) μg/mL。 12h后已经检测不到恩诺沙星和环丙沙星。从上述数值可见 ,恩诺沙星吸收较迅速 ,代谢较快、清除较快 ,表明恩诺沙星与环丙沙星在乳中不会形成残留。另外 ,在 8h内恩诺沙星、环丙沙星的血药、乳药浓度值均高于MIC值 ,所以仍具有抗菌作用。     

宿主防御肽在奶牛乳腺中的表达及应用

宿主防御肽是生物体内产生的一类具有抗菌作用的阳离子多肽,是生物体非特异性免疫功能的重要组成部分。宿主防御肽具有广谱、抗菌、耐热、无毒、不易产生耐药性等诸多特性,在畜牧生产中具有广阔的应用前景。本文主要对宿主防御肽在先天免疫系统中的作用、奶牛乳腺中的表达及乳房炎诊断与治疗应用的研究进展进行综述,为宿主防御肽作为抗生素替代品在畜牧生产中的研究与应用提供理论支持。     

重组黑白花奶牛γ-干扰素在大肠杆菌中的原核表达与鉴定

根据黑白花奶牛γ-干扰素(BovIFN-γ)基因的序列,通过RT-PCR扩增出BovIFN-γcDNA,并将其定向插入原核表达质粒pET-30a(+)和pGEX-6P-1,经DNA测序后,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,分别表达出大小在23和43 ku左右的融合蛋白。通过对诱导剂的浓度、诱导起始时间、诱导持续时间的筛选,对表达条件进行了优化,BL21(DE3)/pET-30a(+)-BovIFN-γ与BL21/pGEX-6P-1-BovIFN-γ的融合蛋白的相对表达量最高时可分别达到菌体总蛋白的60%和45%左右。使用纯化的融合蛋白rHis-BovIFN-γ和rGST-BovIFN-γ进行细胞病变抑制试验,证实表达产物具有较高抗病毒感染活性,在牛肾细胞(MDBK)上抑制水疱性口炎病毒的活性分别为2.15×107和1.21×105U·mg-1。     

血液流变学在奶牛蹄叶炎研究中的应用探讨

蹄叶炎是奶牛常见的营养代谢病之一,血液流变学是研究营养代谢病和微循环障碍的有效方法。笔者等总结了奶牛蹄叶炎和血液流变学的主要研究进展,并探讨了血液流变学在该病研究中的应用前景。     

FADS2基因在奶牛乳腺细胞中的过表达和干扰研究

为了研究脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturases 2,FADS2)基因在奶牛乳腺细胞脂肪酸代谢中的作用,本研究在奶牛乳腺上皮细胞中对FADS2基因进行过表达和干扰,研究FADS2基因表达对脂肪酸合成相关基因的调控及对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的影响。针对FADS2基因的CDS序列设计siRNA和过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP,转染奶牛乳腺细胞检测FADS2基因过表达和干扰对脂肪酸代谢相关基因表达的影响及细胞中甘油三酯含量的变化。结果显示,试验成功获得过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP和干扰片段,转染细胞后具有良好的过表达和干扰效果。FADS2基因过表达后,1-酰基甘油磷酸酰基转移酶(AGPAT1)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、3-磷酸甘油转移酶(GPAM)、脂肪酸延长链5(ELOVL5)、乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)、脂肪酸脱氢酶1(FADS1)、二酰基甘油转酰基酶1(DGAT1)和过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)基因显著下调(P<0.05),脂滴蛋白2(PLIN2)基因极显著上调(P<0.01)。FADS2基因干扰过后可引起AGPAT1、GPAM、ELOVL5、ACAA1、PLIN2和FADS1基因显著上调(P<0.05),脂肪酸合成胰岛素诱导基因1(INSIG1)极显著上调(P<0.01),DGAT1和PPARα基因显著下调(P<0.05)。甘油三酯检测结果显示,FADS2基因过表达和干扰均可降低奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,FADS2基因能调控脂质合成相关基因的表达,对乳腺脂质合成具有调控作用。     

奶牛CRY1基因真核表达载体构建、生物信息学分析及组织表达谱研究

【目的】扩增奶牛隐花色素昼夜节律调节因子1(cryptochrome circadian regulator 1,CRY1)基因全长编码区(coding sequence, CDS),构建该基因的真核表达载体并对其进行生物信息学分析,检测奶牛CRY1基因的表达谱,为后续探究CRY1蛋白的生物学功能提供参考。【方法】以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增CRY1基因CDS区,将其与酶切线性化的pcDNA3.1-3HA空质粒以同源重组法连接,重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-cCRY1;利用在线软件对奶牛CRY1基因进行生物信息学分析。将空质粒pcDNA3.1-3HA和重组质粒pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染至HEK293T细胞,利用Western blotting技术检测奶牛CRY1基因在蛋白水平的表达;利用实时荧光定量PCR检测CRY1基因在奶牛不同组织中的表达量。【结果】试验成功获得1 764 bp的奶牛CRY1基因CDS区序列,且成功构建pcDNA3.1-3HA-cCRY1真核表达载体。奶牛CRY1基因与牦牛、山羊、绵羊相似性在98%以上,且遗传距离较近。生物信息学...     

奶牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达及其活性检测

为了表达奶牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)并对其活性进行检测.根据GenBank中登录的牛GM-CSF基因序列(U22385),设计一对特异性引物;采用RT-PCR方法,以LPS体外诱导的奶牛肺泡巨噬细胞为材料,从总RNA中扩增出奶牛GM-CSF cDNA基因,克隆到pGEM-T载体中,经酶切鉴定与序列测定,结果显示克隆的奶牛GM-CSF基因与GenBank中登录的牛GM-CSF基因序列的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7%和99.3%.构建pET32a-GM-CSF原核表达重组质粒,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白大小约为35 ku.分别运用集落形成试验与MTT比色法测定重组蛋白活性,结果显示重组奶牛GM-CSF蛋白能够诱导粒细胞前体呈集落性生长并具有较强的体外增殖淋巴细胞的活性,为下一步临床试验奠定了基础.     

采食后奶牛瘤胃短链脂肪酸及其吸收相关蛋白表达的研究

本试验旨在研究奶牛采食前后瘤胃中短链脂肪酸(SCFA)浓度的变化及其吸收相关蛋白表达量的差异.试验选用3头体重(720±30)kg且装有瘘管的健康荷斯坦牛(动物伦理审查编号为SXAU-EAW-2019-C002013),采食精粗比为40∶60的日粮(10 kg),试验预试期10d,于第11天饲喂前开始取样,采用气相色谱...     

不同气温对奶牛血液中部分生化指标影响的研究

选择体重相近，体质外貌相似，生产性能相近，泌乳量为15kg左右的健康牛5头。在气温为10℃以下、10～20℃、20～30℃、30～40℃左右维持15d，分别对试验牛采取血处理后，研究气温变化对奶牛血液部分生化指标影响情况，结果表明，气温变化对GPT、GOT无明显影响，血清中TP、CRE明显下降（P〈0.01），血糖含量增加，差异显著（P〈0．05）。     

朊蛋白基因在奶牛生殖系统不同组织中的表达量测定

为了研究疯牛病能够垂直传播的理论基础,我们采用PrP基因做目的基因,GAPDH基因做内参照的相对荧光定量RT-PCR方法,对目的基因和内参基因分别构建标准重组质粒,制备标准曲线,利用标准曲线对采集雌雄奶牛生殖系统的12个不同组织PrP基因表达进行定量。试验结果表明雌雄奶牛的生殖系统各部分组织都有PrP基因表达,其中雄性奶牛的睾丸、附睾和输精管呈现高的表达量,分别为1.16±0.0010、1.81±0.0056、0.68±0.0038;前列腺、精囊腺和尿道球腺呈现中等表达量,分别为0.47±0.0018、0.25±0.0007、0.28±0.0007;阴茎呈现低的表达量为0.18±0.0017;雌性奶牛的子宫、子宫阜呈现高的表达量,分别为2.53±0.0008、1.75±0.0098;卵巢和输卵管呈现中等表达量,分别为1.55±0.0038、1.45±0.0064;阴道呈现低表达量为0.57±0.0036。本研究为阐释PrP基因在奶牛生殖系统的正常表达和正常的生理功能,以及为确定生殖系统在疯牛病垂直传播中的地位和其分子机理奠定了基础。     

血液分析仪在奶牛疾病上的诊断应用

一奶牛场,近期购回的犊牛出现不同程度的持续性腹泻,当地兽医根据临床症状及剖解病理变化选用了多种药物进行治疗,效果都不理想。但采用血液分析仪作辅助检查后,不但提高了对犊牛疾病的认识水平,而且对疾病本质判断和预后断定都有很大帮助。