对虾养殖池中一株弧菌拮抗菌的分离鉴定

从对虾养殖池中分离出1株编号为2013082515(简称菌株15)的菌株,以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为指示菌,分析了菌株15对指示菌的抑菌效果及最低抑菌浓度,同时,分析了菌株15对其他7株弧菌的抑菌效果.结果显示,菌株15对3株指示菌均具有抑菌效果,对鳗弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌的最低抑菌浓度分别为2.50×104、2.50×105、2.50×105 CFU/ml;对其他弧菌也具有一定的抑菌效果.采用注射及浸泡感染方法分析了菌株15对对虾的生物安全性,结果显示,在高浓度时,菌株15对对虾具有潜在毒性.分别用细菌全细胞脂肪酸气相色谱法和16S rDNA序列分析比对法对该菌进行分类鉴定,表明菌株15为一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.).     

海水网箱区沉积物中硫酸盐还原菌（SRB）的分离纯化和鉴定

目前网箱养殖水域的硫酸盐还原菌（SRB）的危害表现日益严重,海水网箱沉积物中SRB分离鉴定尚属空白,针对不同属种的SRB开展生物修复具有一定的意义。在大亚湾大鹏澳网箱养殖沉积物中分离出25株硫酸盐还原菌纯菌株,通过对菌株的形态观察,生理生化特征和遗传特征的一系列研究,结果表明所有菌株均含有脱硫弧菌素,被鉴定为脱硫弧菌属（Desulfovibrio）其中CSRB2、CSRB4、ESRB2鉴定为脱硫脱硫弧菌（Desulfovibrio Desulfovibricans）,ASRB4、BSRB1菌株鉴定为脱硫脱硫弧菌河口亚种（Desulfovibrio Desulfovibricans subsp.aestuarii）,其余菌株鉴定为需盐脱硫弧菌种（Desulfovibrio salexigens）。此海区SRB种类数量特征是需盐脱硫弧菌〉脱硫脱硫弧菌〉脱硫脱硫弧菌河口亚种。     

杂色鲍幼苗“急性死亡脱落症”病原菌分析

从“急性死亡脱落症”发病期的杂色鲍幼苗体内和病苗附着的薄膜上，共分离到4株优势菌，即NA0301、NA0302、NA0303和NA0304。经人工浸泡感染实验证明，从病幼苗体内和苗附着的薄膜上分离到的优势菌株NA0301和NA0302是杂色鲍幼苗的致病菌，它们均为革兰氏阴性、短杆状、极生鞭毛，能运动。常规生理生化和Biolog细菌鉴定系统测试结果表明，菌株NA0301与溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）的亲缘关系最近，而菌株NA0302与溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的亲缘关系最近。为了进一步确定它们的分类学地位，分别测定了溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌的16S rDNA序列，分析相关细菌相应序列的同源性，并构建系统进化树。结果表明，菌株NA0301与溶珊瑚弧菌的亲缘关系最近，菌株NA0302与溶藻弧菌的亲缘关系最近。因此，菌株NA0301和菌株NA0302分别鉴定为：溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：655—661]     

对虾育苗水体副溶血性弧菌耐药性分析

为了解广东、广西沿海2010-2012年对虾育苗水体中副溶血性弧菌的耐药性变化,为育苗期对虾病害预防提供依据.研究依据GB/T4789.7-2008对各地育苗水体样品进行菌株分离、鉴定,并用纸片法进行耐药性检测.结果显示,72株在TCBS培养基上显示绿色的弧菌中检出副溶血性弧菌30株,检出率为41.7％,分离菌株对青霉素、氨苄西林、苯唑青霉素、米诺环素、阿莫西林、四环素、阿洛西林显示高度耐药,对四环素的耐药率达97％.对虾育苗水体在TCBS培养基上显示绿色的弧菌主要以副溶血性弧菌为主,所有菌株耐药性比较强,应加强育苗期抗生素使用的管理.     

一株凡纳滨对虾病原菌的分离、鉴定及其致病力分析

从患病凡纳滨对虾肝胰腺中分离出菌株20100612001,经人工感染实验证实,该分离菌株对凡纳滨对虾的半数致死量为1.44×106CFU/ml。形态学观察和革兰氏染色表明,该菌株为革兰氏阴性,无芽孢,有一根端极鞭毛;呈球杆状、球状、棒状或梨状且有两极浓染现象;在2216E培养基上为透明或半透明的圆形菌落,而在TCBS选择性培养基上为绿色或蓝绿色菌落。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气相色谱分析得出,该菌株与副溶血弧菌、需钠弧菌等的生理生化特性最相似;16SrD-NA序列测定表明,该菌株与弧菌属中几株病原菌的同源性均达到98.9%以上。在分子进化树中该菌株与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的进化地位最接近。综合上述实验结果分析得出,该细菌分离物为副溶血弧菌。     

生食三文鱼中副溶血性弧菌污染调查及耐药性分析

探究了广州市售生食三文鱼中副溶血性弧菌的污染状况及分离株的耐药性,为生食三文鱼的食用安全及食源性疾病的防控提供依据。2016年在广州市的批发市场、农贸市场和超市共采集生食三文鱼65份,副溶血性弧菌的分离按照GB 4789.7—2013方法,采用全自动微生物鉴定仪进行副溶血性弧菌的鉴定及药敏试验。2016年广州市生食三文鱼副溶血性弧菌总体检出率为35.38%。7月副溶血性弧菌检出率最高(50%),10月次之,最低为1月。批发市场、农贸市场和超市的副溶血性弧菌检出率分别为45%,9%、9%,三者间有极显著差异(P0.01)。从65份样品中分离得到63株副溶血性弧菌,分离株的药敏分析发现,所有分离株对阿莫西林、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和呋喃妥因等12种抗生素敏感,少数菌株对复方新诺明耐药(6.35%),大多数菌株对氨苄西林耐药(98.41%)。广州市售生食三文鱼中副溶血性弧菌污染较严重,分离的副溶血性弧菌存在一定程度的耐药情况,今后应加强对生食三文鱼中副溶血性弧菌的监测和抗生素的使用管理。     

斑节对虾“红体病”细菌性病原的初步研究

从患“红体病”的斑节对虾中分离到８个菌株,通过致病力试验证实其中两个菌株是引起斑节对虾“红体病”的主要病原,使对虾死亡率分别达到７０％和９０％。根据生化试验,确定这两个菌株分别是嗜水气单胞菌和副溶血弧菌。抗药性实验的结果表明,嗜水气单胞菌菌株对强力霉素较为敏感,副溶血弧菌菌株对氟哌酸、红霉素、青霉素和强力霉素较为敏感。     

鳗源创伤弧菌的鉴定与血清型分析

本研究对分离自发病鳗鲡的疑似创伤弧菌进行鉴定及血清型分析,经生化鉴定,从发病鳗鲡中得到7株创伤弧菌;设计了创伤弧菌溶血素基因(vlly)特异性引物,并对分离菌进行了PCR检测,创伤弧菌均可扩增出溶血素基因352 bp的目标片段,而非创伤弧菌未扩增出相应的片段;制备了创伤弧菌抗O抗原血清,凝集反应显示所得到的鳗源创伤弧菌抗O抗原血清不能与人源创伤弧菌1.1758发生凝集反应,菌株FJ03-X2抗O抗原血清可与大部分的鳗源创伤弧菌发生凝集反应。以上研究结果表明,基于溶血素基因设计的PCR引物具有良好的特异性,可用于创伤弧菌检测,鳗源创伤弧菌血清型不同于其他来源的创伤弧菌,菌株FJ03-X2的O抗原具有良好的免疫原性,可作为创伤弧菌疫苗研发的候选菌株。     

外排泵抑制剂对海水养殖源弧菌酰胺醇类药物耐药性的影响

通过检测从海水养殖中分离的对氟苯尼考低敏感弧菌菌株中常见酰胺醇耐药基因的携带情况,来分析外排泵抑制剂对弧菌酰胺醇耐药性的影响,旨在研究主动外排机制在我国海水养殖源弧菌耐药中的作用。本研究从前期分离的海水养殖源弧菌中挑选出41株对氟苯尼考低敏感的菌株,运用琼脂稀释法测定了这些菌株对酰胺醇类药物(氯霉素和氟苯尼考)的敏感性;利用PCR方法检测了这些菌株的酰胺醇外排泵耐药基因和整合子的携带情况,包括外排泵基因floR、cmlA、pexA、fexA、fexB和optrA,以及Int1、SXT和ISCR1整合子相关基因;同时研究4种外排泵抑制剂对弧菌氯霉素、氟苯尼考最小抑菌浓度(MIC)的影响,利用琼脂稀释法检测41株弧菌分别加入甲基吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone,NMP)、利血平(reserpine)、羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone,CCCP)和苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺(Phe-Arg-β-naphthylamide,PAβN)4种外排泵抑制剂前后对氯霉素和氟苯尼考的MIC值的变化情况。副溶血弧菌(14株)、溶藻弧菌(17株)、哈维氏弧菌(8株)、创伤弧菌(2株)共41株氟苯尼考低敏感弧菌敏感度检测结果显示,氟苯尼考耐药菌株39株、氯霉素耐药菌株11株。41株氟苯尼考低敏感弧菌菌株中,酰胺醇类外排泵基因floR检出率为100%,而cmlA的检出率仅为17.1%,其他4个外排泵基因均未检出;整合子相关基因Int1、SXT和ISCR1的检出率分别为46.3%(19/41)、46.3%(19/41)和63.4%(26/41)。41株弧菌中,添加NMP、利血平、CCCP和PAβN后,分别有0株、2株、10株和2株弧菌为氯霉素外排阳性菌;分别有1株、1株、15株和3株弧菌为氟苯尼考外排阳性菌。研究表明,CCCP被验证可以作为有效治疗酰胺醇类药物耐药弧菌的外排泵抑制剂。     

对虾养殖池副溶血弧菌的分离鉴定及其耐药特征、毒力基因分析

为了解对虾养殖池中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐药性和毒力基因的携带情况,2018年从山东4个地区的对虾养殖池收集分离副溶血弧菌,采用Kirby-Bauer纸片法检测其对12种抗生素的耐药性,用PCR方法检测其携带耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh)的情况。从对虾养殖池共分离副溶血弧菌50株。药敏实验结果显示,副溶血弧菌对庆大霉素、硫酸新霉素和氨苄西林的耐药情况最为严重,耐药率分别高达98%、90%和86%,对氟苯尼考、氯霉素、头孢他啶等敏感性较高,耐药率分别为10%、10%和20%。88%的菌株具有多重耐药性。毒力基因检测结果显示,所有菌株均不携带tdh基因,4%的菌株表现为trh阳性。本研究表明,对虾养殖水环境中的副溶血弧菌对抗生素的耐药性较为严重,应加强副溶血弧菌的病原学监测,在养殖过程中合理使用抗生素,以实现水产养殖业健康发展。     

斜带石斑鱼消化道乳酸菌在模拟胃肠道环境中的存活

从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)幼鱼消化道分离到3株乳酸菌,通过抑菌试验筛选出抑菌效果较好的2株菌(MM1和MM4),经生理生化鉴定结合16SrRNA基因测序分析,MM1菌株鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),MM4菌株鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。进一步研究了MM1和MM4的体外生长特性,及其对不同pH值的人工胃液、含有不同浓度胆盐的人工肠液及高温的耐受能力。结果表明,MM1和MM4均在培养6h左右进入对数生长期。对人工胃液的耐受能力相似,pH4.0和3.0的人工胃液对2株菌存活的影响较小,而pH2.0的人工胃液对2株菌的影响较大,经2h处理后两者的存活数即下降到105CFU/mL,经4h处理后的存活数低于5.0×103CFU/mL。MM1和MM4对含不同浓度胆盐的人工肠液均具有较好的耐受能力,含中低浓度胆盐(0.1%～0.3%)的人工肠液对2株菌的存活影响很小,处理3h后2株菌的存活数均维持在107CFU/mL以上;高浓度胆盐(0.5%～0.7%)处理3h后2株菌的存活数明显下降,但活菌数仍维持在105CFU/mL以上。MM1和MM4具有一定的耐高温能力,60℃处理30min二者存活数在107CFU/mL以上;80℃处理30min二者存活数在106CFU/mL以上。结论认为,2株乳酸菌具有生长速度快、抑菌能力强、对胃肠道环境和高温耐受能力较强的特点,具有作为益生菌的应用潜力。     

养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性分析

为了解引起养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性情况,针对2002-2010年由不同地区病样分离的27株细菌性病原进行了16S rDNA鉴定,并采用K-B法测定了27株细菌对22种抗生素的耐药性,分析了病原菌的耐药谱及耐药率变化.结果显示,大菱鲆腹水病病原菌主要有大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas espejiana).山东青岛地区以大菱鲆弧菌为主,威海地区以迟钝爱德华氏菌为主,烟台地区菌株种类分布平均.5类细菌对青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、复方新诺明耐药率高于50％.只有1株迟钝爱德华氏菌对氟苯尼考产生了耐药,其余菌株对其均没有耐药性,且在长期使用中不易产生耐药性,证实氟苯尼考为当前防治腹水病的一种良好抗菌药物.27株病原菌的耐药谱数量为27个,每个菌株具备自己独特的耐药谱,74.1％的菌株对10种以上的抗菌药物产生了耐药性,均有多重耐药性.     

对虾育苗中常用海洋微藻抑菌作用的研究

研究了等鞭金藻、三角褐指藻、扁藻对对虾育苗中致病菌鳗弧菌、假单胞菌的抑菌效果。结果表明,等鞭金藻、三角褐指藻、扁藻的水溶性物质及脂溶性物质对鳗弧菌有抑制作用;等鞭金藻、三角褐指藻的水溶性物质及等鞭金藻、三角褐指藻、扁藻的脂溶性物质对假单胞菌有抑制作用。在抑菌试验中,等鞭金藻、三角褐指藻、扁藻密度达10×104/ml时,对对虾育苗池水的抑菌作用较好,特别是对弧菌的抑制效果明显。     

半滑舌鳎溃疡病病原菌的分离、鉴定及其致病性分析

采用2216E和TCBS培养基分别从患溃疡病半滑舌鳎的肠道和体表病灶分离获得菌株40株,经血平板检验分离菌株的溶血活性,体外筛选并鉴定出3株潜在致病性菌株,即哈维氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血性弧菌。通过将3株潜在致病菌与健康半滑舌鳎的肠道上皮细胞共培养,检测病原菌刺激后半滑舌鳎肠道上皮细胞相关免疫基因的相对表达量及共培养后肠道上皮细胞的凋亡率,对病原菌的致病性进行细胞水平的筛选。结果显示,经哈维氏弧菌刺激后肠道上皮细胞白介素10基因(IL-10)表达量极显著上调,说明哈维氏弧菌引起的共培养上皮细胞免疫反应最为剧烈,且哈维氏弧菌与肠道上皮细胞共培养后导致细胞的凋亡率高达48.3%,其次为溶藻弧菌(36%)和副溶血性弧菌(34.5%),推测哈维氏弧菌为半滑舌鳎溃疡病高致病性弧菌。通过对半滑舌鳎进行浸浴回感实验,结果发现,哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌人工回感后第6天半滑舌鳎的累计死亡率分别为100%、95%和75%,与细胞水平检测结果相吻合。实验表明,所筛选到的3株弧菌均具有较强的毒性和致病性,尤其以哈维氏弧菌致病性最强,并由此推测半滑舌鳎溃疡病可能由多种致病菌共同感染所致。     

Benefits of live phytoplankton, <Emphasis Type="Italic">Chlorella vulgaris</Emphasis>, as a biocontrol agent against fish pathogen <Emphasis Type="Italic">Vibrio anguillarum</Emphasis>

The ability of the probiotic bacterium Sulfitobacter to inhibit the growth of two virulent strains (psh-9019 and ATCC 43306) of the fish pathogenic bacterium Vibrio anguillarum was tested. Probiotic and pathogenic bacteria were inoculated individually or together in three different types of media. Two of the phytoplankton media tested were filtrates of phytoplankton Chlorella vulgaris cultures, either the live phytoplankton (live-CV) or a condensed phytoplankton (condensed-CV). Phytoplankton culture medium, ESM, was used as a control medium without phytoplankton. In ESM, Sulfitobacter decreased the viable cell counts of both V. anguillarum strains by tenfold. In the live-CV filtrate, V. anguillarum was eradicated by Sulfitobacter within one week. Although colony counts of strain ATCC 43306 declined during the two-week co-incubation with Sulfitobacter, its growth was not fully inhibited; however, the counts were tenfold lower than that in control ESM medium. Neither of the pathogenic V. anguillarum strains were inhibited nor eradicated by Sulfitobacter in the condensed-CV filtrate medium. Our study indicates that commercially available condensed phytoplankton can enhance the growth of V. anguillarum. Thus, the addition of live phytoplankton, including the introduction of Roseobacter clade bacteria to fish larvae tanks, leads to better biocontrol of the fish pathogen V. anguillarum.     

暗纹东方鲀非01霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测

在对养殖暗纹东方病害调查中，从呈典型症状病鱼腹腔和肠道粘液中分离到2株（J-1和H-3）菌株，经生化特性和血清型鉴定为非01群霍乱弧菌(Non-01 Vibrio cholerae)。注射、创伤和浸泡3种方式进行人工感染试验表现出较强的致病性，出现症状与自然发病鱼相同。为进一步确认分离菌株的分类地位，使用P1、P2引物，以非01群霍乱弧菌N92001菌株和01群霍乱弧菌N16961菌株为对照，对分离菌株进行PCR扩增，得到451bp的DNA片段。根据现有霍乱弧菌肠毒素ctxA基因序列设计引物P3,P4，以N16961菌株为阳性对照，PCR扩增结果均得到大小为400 bp的DNA片段。在对H-3菌株的扩增片段进行纯化、克隆和测序，得到407bp序列，该菌株与N16961菌株中肠毒素ctxA基因序列的完全一致，证实该片段源于ctxA基因。进一步说明从暗纹东方体内分离到的J-1和H-3菌株具有霍乱肠毒素ctxA，有一定的致病力。     

青岛陆源排污口邻近海域异养细菌的组成与分布

对青岛近海度假区、港口区、养殖区、工业区4类排污口邻近海域异养细菌的组成与分布进行了调查研究,采用海洋异养细菌平板涂布培养法分离细菌,基于16S rDNA的扩增性DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)进行聚类筛选并测序鉴定。结果显示,青岛排污口邻近海域可异养培养的菌株分布于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)4个细菌类群,变形菌门细菌数量占总测序数量的68%,其中γ-变形菌纲的数量在变形菌门中占88%;不同海域中细菌组成与分布有所不同,放线菌门和拟杆菌门的细菌种类较少且各海域分布有所不同,但γ-变形菌纲的弧菌属细菌(Vibrio sp.)在4类海域中均被发现,占总检测量的18.54%,其中溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)占弧菌总量的25%。不同海域也检测到V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.campbellii、V.parahaemolyticus等水产养殖业的潜在致病菌。根据16S rDNA系统进化关系和细菌门类聚类分析得到的结论推断,工业区与养殖区海域的细菌组成和分布相似度较高,推断各海域的细菌组成与排污口类型有一定相关性。     

山东近海主要养殖动物的弧菌检测与病害防治的研究

本文从１９９９年秋季采集的山东近海鲈鱼、牙鲆、黑鲷、梭子蟹、牡蛎等５种主要养殖动物中分离出１１０个菌株,经形态、生理、生化测定,由计算机数值分类和《伯杰氏细菌鉴定手册》相结合,鉴定出溶藻胶弧菌、副溶血弧菌等９种弧菌属弧菌和１种嗜水气单胞菌。文中尚对养殖生物弧菌病害的防治作了初步探讨。     

凡隆气单胞菌(Aeromonas veronii)拮抗菌4-1-3的筛选鉴定及其活性物质初探

凡隆气单胞菌是泥鳅养殖中容易发生而且致死率较高的病原菌之一。为筛选凡隆气单胞菌拮抗菌、研发防治此病害的生物制剂,采集泥鳅养殖池底泥样品,通过滤纸抑菌圈法筛选凡隆气单胞菌拮抗细菌,结合形态观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列分析进行菌株鉴定。采用硫酸铵沉淀和离子交换层析方法分离纯化抑菌物质,电泳检测其分子量。结果显示,从样品中分离到17株细菌,其中筛选出的拮抗菌4-1-3,能够高效抑制凡隆气单胞菌,抑菌圈直径达到15.2 mm。经菌株鉴定后命名为Pseudomonas fluorescens 4-1-3。该菌产生的抑菌物质为胞外蛋白,分子量约为100 kDa,推测该物质是荧光假单胞菌产生拮抗物质的一种新类型,有望进一步研制成防治水产病害的生物制剂。