外源激素处理供体奶牛活体采卵生产胚胎的研究

选择6头3～6岁健康荷斯坦、空怀母奶牛随机分为3组,每组2头,分别用外源激素孕马血清促性腺激素（PMSG）、促卵泡素（FSH）、空白对照处理供体奶牛,4 d后应用B型超声波导引采卵, 以研究外源激素对活体采卵效率和体外生产胚胎的影响.试验结果表明：FSH组每头次平均可采卵泡12.07个,获可用卵母细胞5.57枚,与PMSG组比较差异显著（P＜0.05）,与对照比较差异极显著（P＜0.01）;PMSG组每头次平均可采卵泡为6.63个,获可用卵母细胞数2.96枚,与对照组比较差异不显著（P＞0.05）;各组活体采集的卵母细胞体外受精分裂率、囊胚率也无显著差异.表明可用外源激素处理供体奶牛活体采卵生产胚胎,但以FSH处理效果较好.     

卵丘细胞在牛卵母细胞体外受精生产胚胎中的作用

牛体外胚胎生产是解决胚胎移植产业化胚胎来源的有效技术方法,其包括卵母细胞体成熟、体外受精和受精卵体外胚胎.而体外受精胚胎的质量是影响胚胎移植妊娠率与犊牛成活率的重要因素.体外受精过程中卵丘细胞分泌的一些重要物质(类固醇激素、细胞生长因子等),对牛卵母细胞体外成熟、体外受精以及受精卵体外发育都具有重要的促进作用.本文综合了近年来该领域的研究进展,着重分析了卵丘细胞对卵母细胞体外成熟,以及体外受精过程中卵丘细胞的分泌功能、质量和共培养体系对卵母细胞体外受精效率的影响.     

卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

本试验探讨了卵母细胞周围不同类型的卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟、受精及其随后的胚胎发育的影响。卵母细胞周围一般都含有多层卵丘细胞。按卵丘细胞的层数及形态将卵母细胞大致分为５类：（１）无卵丘细胞；（２）有２～３层卵丘细胞；（３）有４～５层卵丘细胞；（４）有６层以上卵丘细胞；（５）异常者（即卵母细胞外周有较厚的透明胶状物而无正常卵丘细胞）。以上５种卵母细胞经体外成熟培养并受精后，其卵裂率（分别为：４８．８％，７０．９％，８４．４％，８２．１％，６８．２％）及囊胚发育率（分别为：０．０％，１７．８％，３３．３％，５４．６％，２５．０％）除异常者外均随着卵丘细胞层数的增加而提高（Ｐ＜０．０５）。对含有２～６层卵丘细胞的卵母细胞成熟后进行不同程度的剥离处理。然后按剥离程度分为３组：（１）全部剥离；（２）仅剩放射冠；（３）放射冠外有２～３层卵丘细胞。受精后３组间的卵裂率无显著差异（分别为：８１．７％，８５．２％，８４．４％）。而囊胚发育率（分别为：１６．８％，２３．８％，２３．４％），全部剥离组明显低于其他两组（Ｐ＜０．０５）。试验结果表明卵丘细胞对卵母细胞的体外成熟有促进作用，从而影响随后的受精及胚胎发育。     

不同发育阶段和质量的牛体外受精胚胎冷冻后的效果

胚胎的冷冻是用二步降温法，将胚胎降至－２５℃，并直接投入液氮。试验Ⅰ，将６～８日龄的牛胚胎置于显微镜下，按发育期把胚胎分成桑椹胚、早期囊胚、囊胚、扩展囊胚四个阶段，然后分别平衡在１．５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖ＰＢＳ液中，２０ｍｉｎ后进行冷冻。解冻后，各阶段的胚胎孵化率分别为：２９．０％，７３．２％，７４．６％，６１．２％。桑椹胚的孵化率极显著（Ｐ＜０．０１）地低于其它三个阶段的胚胎，其它三个阶段之间无显著差异（（Ｐ＞０．０５）。试验Ⅱ，将７日龄的囊胚，在显微镜下鉴定质量并分为１～５级，仅１，２级胚胎用于冷冻。试验结果表明：每管装２枚胚胎时，有１枚胚胎以上孵化的细管数，１级的有９３．８％（４５／４８），２级的有７７．４％（２４／３１），它们之间差异显著（Ｐ＜０．０５）。每管装３枚胚胎时，有２枚胚胎以上孵化的细管数，１级的有８７．５％（４２／４８），２级的有６８．０％（１７／２５），二者间差异显著（Ｐ＜０．０５）。本研究结果表明：不同阶段和质量的牛体外培养胚胎冷冻后对存活率有显著的影响。     

蛋白质添加剂对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外发育的影响

为了探讨蛋白质添加剂对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外培养的影响，通过２３３８个卵母细胞，按２×２×２设计方法进行试验，即在体外成熟、体外受精及早期胚胎体外培养三个阶段的培养液中，添加与不添加蛋白质物质（体外成熟与体外培养为发情母牛血清，体外受精为牛血清白蛋白）。试验结果表明，在体外成熟阶段的培养液中，有无发情牛血清对牛卵母细胞的核成熟无显著影响（有血清组为８９％，无血清组为９０％）。但在体外受精阶段，受精液中含有牛血清蛋白质处理组的卵母细胞受精后，分裂率显著地高于无血清蛋白质组（Ｐ＜０．０１，８４％ｖｓ７２％）。同样，在早期胚胎体外培养阶段，含有发情牛血清的培养液大大促进早期胚胎的发育，与无血清组比较，其差异性极显著（Ｐ＜０．０１，３５％ｖｓ２１％）。同时，含血清组的胚胎孵化率亦显著地高于无血清组（Ｐ＜０．０１，６９％ｖｓ４７％）。本研究表明，蛋白质添加剂在ＩＶＦ和ＩＶＣ阶段是必需的，而在ＩＶＭ阶段则不甚重要。     

利用改善液培养牛卵母细胞和早期胚胎的研究

在基础液 M199配制的培养液中,加入牛卵泡内的颗料细胞,置39℃、5%的 CO_2培养箱中培养72 h 后回收过滤液(简称改善液)。用这种不同浓度和保存时间的改善液,在体外成熟培养牛卵母细胞和胚胎时分别代替培养液和培养液加颗粒细胞制作的单层细胞培养体系。结果表明:(1)在基础液 M199中分别加入0%、25%、50%、75%、100%改善液和对照纽,其分裂率(78.7%～83.0%)组间均无差异(P>0.05);受精卵在体外培养至囊胚率,其中0%改善液组为30.4%,与对照组46.5%有显著差异(P<0.01);囊胚孵化率0%和25%改善液组分别为57.1%和57.9%,与对照组76.6%有显著差异(P<0.01)。(2)改善液保存时间为0 d,-4℃ 5～7 d,-20℃180 d 和对照组,分裂率(80.5%～86.3%)组间均无差异(P>0.05);受精卵在体外培养至囊胚率和囊胚孵化率,其中-20℃保存180 d 组分别为31.1%和54.5%,与对照组46.1%和72.0%有差异(P<0.05)。     

血清添加时间及胚胎培养模式对产业化生产牛胚胎的影响

在利用体外受精技术产业化生产牛胚胎的体系中,体外受精卵一开始就培养在已加入犊牛血清（FBS）的改良SOF液的实验组,其卵裂率（80.6%,253/314）和可冷冻胚胎率（20.8%,129/620）与在体外受精（IVF）3 d后才往胚胎培养体系中加入FBS的结果差异不显著（相应为83.4%,262/314和24.4%,151/620,P〉0.05）;而囊胚率差异显著（分别为41.8%,259/620和 48.5%,301/620,P〈0.05）.在IVF后第3天将培养体系中的未受精卵及发育迟缓的2-细胞阶段胚胎剔除与否的不同胚胎培养模式对其后囊胚的产量和质量均无显著影响.     

受精液、咖啡因、精液和抗菌素对猪卵母细胞的体外受精及早期胚胎发育的影响

探讨精液的不同处理、抗菌素、受精液种类和咖啡因对体外成熟猪卵母细胞的体外受精和早期胚胎发育的影响。结果表明：(1)受精液中抗菌素添加与否对体外成熟猪卵母细胞的体外受精无显著影响，而且不添加抗菌素的受精液也无严重微生物污染；(2)用猪冷冻精液与新鲜精液进行猪卵母细胞的体外受精对早期胚胎发育无显著影响；(3)在受精液mTBM中添加5mmol／L咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的早期发育是最好的；(4)用mTBM进行猪卵母细胞体外受精的卵裂率明显高于用mBO进行体外受精的卵裂率，但其第8d囊胚率明显低千用mBO进行体外受精的，mTBM和mBO各有优势；(5)在洗精子液含有高浓度咖啡因(15mmol／L)的情况下，无咖啡因的受精液也可进行猪卵母细胞的体外受精并发育到囊胚阶段，在受精液中添加不同浓度(0～10mmol／L)的咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的卵裂率和第8d囊胚率都无显著影响，受精液中咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的第6d桑椹胚 囊胚率的影响因浓度而异．其中以添加5mmol／L为最佳，随着浓度上升效果开始下降。     

牛磺酸、谷酰胺、改良CR1和改良CR2培养液对牛受精卵体外发育的影响

本研究探讨了牛磺酸、谷酰胺、改良CR1 (CR1 无机盐成分 10% 胎牛血清) 和改良CR2 培养液(改良CR1 液 1 m m ol/L谷酰胺和绵羊输卵管分泌液浓度的多种氨基酸)对牛卵子体外受精后的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数的影响。结果表明: 牛磺酸和谷酰胺对牛卵子受精后体外发育的影响依赖于胚胎培养液种类; 利用改良CR1 和改良CR2 培养液可成功生产可移植胚胎, 但它们所生产的可移植胚胎的效率无显著差异, 利用改良CR1 培养液生产可移植胚胎的成本更低一些。     

水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究

利用RT-PCR反应,从纹枯菌诱导的水稻叶片cDNA中克隆了1个水稻几丁质酶基因RC7的全长编码序列（ORF）。通过亚克隆方法,RC7与原核表达载体pGEX-4T-1上的GST融合,构建成GST-RC7重组蛋白的原核表达载体pGST-RC7,然后,将其转化到大肠杆菌细胞中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,获得了以包涵体形式高效表达的GST-RC7。经过洗涤、溶解（变性）、复性及纯化等处理,包涵体中GST-RC7得到溶解、复性和纯化。纯化的复性GST-RC7蛋白具有几丁质酶活性。对6种重要作物病原真菌进行体外抑菌活性分析的结果表明, RC7可显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯菌、小麦赤霉菌、棉花黄萎菌、烟草赤星菌的菌丝生长,说明RC7可作为上述植物病害抗性基因育种的重要基因。