PCR检测对虾白斑综合征病毒的组织特异性

该研究提取了95%酒精保存的病虾组织(鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼)的基因组总DNA,并进行了对虾白斑综合征病毒的PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示,病虾组织(鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼)有轻微的跑带现象,鳃和肌肉比表皮、附肢和复眼的基因组总DNA电泳条带亮。PCR检测结果发现,对虾不同组织的阳性检出率高低顺序如下:鳃肌肉=表皮附肢复眼。研究结果说明,鳃和肌肉可作为对虾白斑综合征病毒PCR检测的合适部位。     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)致病相关基因研究进展

介绍了最近几年白斑综合征病毒WSSV致病相关基因的研究进展,包括病毒囊膜蛋白基因、核衣壳蛋白基因、病毒复制过程的关键酶基因、细胞因子受体基因、潜伏相关基因和抑制宿主细胞凋亡机制的基因等。     

凡纳对虾白斑综合征病毒的检测和预防

20世纪 90年代以来 ,日本、泰国、中国等许多亚洲国家和地区因虾病流行 ,对虾养殖产量锐减 ,造成重大经济损失。其中危害最严重的就是白斑综合征 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ ,ＷＳＳ) ,其病原体为白斑综合征病毒 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ ,ＷＳＳＶ) [1 - 3] 。 1 993年 5 - 8月 ,我国沿海从南到北对虾养殖场发生了大面积的对虾爆发性流行病 ,损失非常严重[4,5] 。关于ＷＳＳ的研究已成为近年来国内外水产养殖病害研究的热点[6- 1 2 ] 。随着ＷＳＳＶ研究的深入 ,有关ＷＳＳ的病原、病理、诊断方法、检测技…     

凡纳对虾白斑综合征病毒的检测和预防

20世纪 90年代以来 ,日本、泰国、中国等许多亚洲国家和地区因虾病流行 ,对虾养殖产量锐减 ,造成重大经济损失。其中危害最严重的就是白斑综合征 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅ ,ＷＳＳ) ,其病原体为白斑综合征病毒 (ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ ,ＷＳＳＶ) [1 - 3] 。 1 993年 5 - 8月 ,我国沿海从南到北对虾养殖场发生了大面积的对虾爆发性流行病 ,损失非常严重[4,5] 。关于ＷＳＳ的研究已成为近年来国内外水产养殖病害研究的热点[6- 1 2 ] 。随着ＷＳＳＶ研究的深入 ,有关ＷＳＳ的病原、病理、诊断方法、检测技…     

感染白斑综合征病毒的斑节对虾免疫酶变化特征

研究了斑节对虾(Penaeus monodon)感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)后的发病情况和4种免疫酶活性的变化特征。通过对斑节对虾进行WSSV急性攻毒试验,发现在感染50h左右出现死亡高峰,感染60h后大部分死亡虾出现明显的白斑。血液酚氧化物酶(PO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)活性在感染WSSV后都呈现先降低再升高再降低的趋势,并在感染后60h左右,活性达到最大值。肝脏、肌肉组织中的ACP、SOD活性变化规律与其在血液中的变化类似,肝脏中的ACP、SOD活性明显高于肌肉组织中的活性。     

白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104¹05。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

对虾白斑综合症病毒综述

对虾白斑综合症病毒（W SSV）是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。W SSV是一种无包涵体的杆状病毒,PCR诊断技术具有简便快速、灵敏度高等优点,适合于大规模检测。对W SSV的分子生物学进行深入研究,优化现有的检测技术,积极探索新的检测方法,有效防止W SSV感染产生的危害,以促进对虾养殖业的发展。     

白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104~105。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

不同靶点shRNA干扰对虾白斑综合征病毒增殖效果分析

设计合成了靶向对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组不同佗点的5个shRNA:RR9、RR1、DP1、DP2和PK1,并在凡纳滨对虾体内实施了RNA干扰(RNAi)抗WSSV增殖的试验.结果显示:5个shRNA不同程度地抑制了WSSV的复制,降低了对虾的死亡率,其中,靶向病毒核糖核酸还原酶的shRNA RR9的RNA干扰效果最佳.     

家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响

为研究饲料中添加家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响,在基础饲料中分别添加家蝇抗菌肽提取物0、1、2、3、4、5 g/kg,配制6种试验饲料.选取960尾健康、初始体均重为0.86(±0.01)g的凡纳滨对虾,分为6组,饲养8周后进行攻毒试验.结果显示,当抗菌肽提取物添加量为3 g/kg时,72 h内的累计死亡率与对照组相比显著降低.血细胞数量和吞噬率均以3 g/kg组最高,显著高于对照组、1、5g/kg组.当抗菌肽提取物添加量为2～3 g/kg时,对虾血清过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)活性和总抗氧化能力(T-AOC)均维持在一个较高的水平,且显著高于对照组;4 g/kg组超氧化物歧化酶(SOD)活性与对照组相比显著升高,肝胰腺AKP活性、T-AOC水平均以4 g/kg组最高,显著高于对照组;3g/kg组LZM活性显著高于对照组、1、4、5 g/kg组.结果表明,饲料中添加适量的家蝇抗菌肽可以提高凡纳滨对虾的免疫力和抗白斑综合征病毒的能力.     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白.将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶NdeⅠ、Xho Ⅰ酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a(+)表达载体上.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后成功地构建了VP28基因原核表达载体pET-28a-VP28.转化菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示含有与预期大小一致的约30 ku蛋白带,主要以包涵体形式表达.采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95％的大肠杆菌重组蛋白VP28.该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量.实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14 μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45％.这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合征奠定了基础.     

白斑综合征病毒感染对克氏原螯虾肠道菌群的影响

为揭示白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)感染克氏原螯虾(Procambarus clarkii)后对其肠道菌群的影响,运用16SrDNA基因的高通量测序技术分析健康与人工感染WSSV的克氏原螯虾的肠道菌群的组成及多样性。结果显示,感染组与对照组在肠道丰度及多样性无显著差异,但其优势菌群组成发生变化。对照组优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)和软壁菌门(Tenericute),分别占75.42%和19.17%;感染组肠道优势菌门为变形菌门和拟杆菌门(Bacteroidetes),分别占78.14%和17.38%。利用LEfSe分析差异菌属发现,感染组与对照组相比,Candidatus bacilloplasma丰度显著减少(P0.05),拟杆菌科(Bacteroidaceae)和黄杆菌科(Flavobacteria)的丰度显著上升(P0.05)。此外,部分潜在病原菌如黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)的丰度在感染后显著升高(P0.05)。以上结果说明WSSV感染导致克氏原螯虾肠道菌群发生变化,提示WSSV或可通过干扰肠道稳态致病。     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV) 的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶Nde I、Xho I酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a( )表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后,证实成功地构建了 VP28 基因原核表达载体pET-28a-VP28。转化菌经 IPTG 诱导,SDS-PAGE 显示含有与预期大小一致的约30kDa蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95%的大肠杆菌重组蛋白VP28。该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量。实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45%。这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合症奠定了基础。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31与该病毒侵染的相关性

白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体.根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp.通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFAST BAC HTB上.重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带.用Ni2 柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验.中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能起着重要作用.     

宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的检测与分析

为了解浙江宁波地区南美白对虾白斑综合征病毒（WSSV）的流行情况,为科学防控该病提供参考依据,应用PCR方法对2004～2008年采自宁波地区对虾养殖场的1201份南美白对虾样品进行WSSV检测。结果表明,1201份样品中有364份样品呈阳性,总阳性率为30.31%;2004～2008年的WSSV年平均阳性检出率均较高,且呈不规律变化,其中以2006年南美白对虾白斑综合征发病最严重,阳性感染率达42.66%,但2006～2008年WSSV的年平均阳性检出率呈下降趋势。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP31与该病毒侵染的相关性

白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体.根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp.通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFAST BAC HTB上.重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带.用Ni2 柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验.中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能起着重要作用.     

黄芪多糖对克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的效果研究

研究了基础饲料中添加不同浓度的黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的效果。用添加0%、0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖的基础饲料作为药饵,投喂20 d后,对各组经PCR检测WSSV呈阴性的健康克氏原螯虾进行WSSV病毒悬液腹节背部注射攻毒试验,当添加0%黄芪多糖的阳性对照组中死亡率达到100%时,添加0.2%、0.4%、0.8%黄芪多糖实验组的死亡率分别为(86.67±13.33)%、(91.11±7.70)%、(73.33±17.64)%。为了评价黄芪多糖对克氏原螯虾各器官组织的影响,对其鳃、肝胰腺、心肌组织进行病理组织切片观察,结果发现:添加0%黄芪多糖的阳性对照组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺、心肌组织出现细胞排列无序、细胞破裂、核仁皱缩等明显的病理变化;而添加0.8%黄芪多糖的实验组中克氏原螯虾的鳃、肝胰腺组织未见明显病变,心肌组织核仁出现一定程度的皱缩,但细胞尚未破裂。研究表明:与阳性对照组相比,添加0.8%的黄芪多糖可提高26.67%的存活率,对克氏原螯虾抗WSSV感染有很好的提高效果,可望在生产中收到良好的经济效益。     

维生素C对白斑综合征病毒(WSSV)侵染后红螯光壳螯虾血淋巴免疫机能的影响

为探讨维生素C(VC)对白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)侵染后红螯光壳螯虾Cherax quadricarinatus血淋巴免疫机能的影响,在基础饲料中添加不同水平的VC(0(对照)、100、200、400、800、1 600、3 200 mg/kg),投喂初始体质量为(20.31±2.09)g的红螯光壳螯虾8周,在养殖的第2、4、6、8周测定各组的相关免疫指标,养殖试验结束后在0、400、800 mg/kg VC添加组进行WSSV攻感染试验,测定WSSV侵染后血细胞总数、吞噬活性,以及血淋巴中溶血活性、凝集活性、抑菌率的变化,并分析凝集素基因(C-lectin)表达量的变化。结果表明:WSSV侵染后,红螯光壳螯虾血细胞总数及小颗粒细胞、透明细胞2种类型的血细胞数量均显著减少(P<0.05),而大颗粒血细胞数量则显著增加(P<0.05),至96 h时,800 mg/kg VC添加组血细胞总数显著高于对照组(P<0.05);血淋巴溶血活性、凝集活性和抑菌率随着WSSV侵染时间的延长,各组均呈先升高后降低的趋势,至96 h时,800 mg/kg VC添加组血淋巴凝集活性和抑菌率显著高于对照组(P<0.05);红螯光壳螯虾C-lectin基因在血细胞中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),至96 h时,试验组血细胞中的C-lectin基因表达量均保持在较低水平,且800 mg/kg VC添加组基因表达量显著高于对照组和400 mg/kg VC添加组(P<0.05)。研究表明,VC能在一定程度上增强红螯光壳螯虾的免疫机能,当添加量为800 mg/kg时,能显著增强血细胞及血淋巴的免疫活性,对红螯光壳螯虾防御WSSV侵染起到一定的免疫保护作用。     

VP28蛋白鸡源抗WSSV卵黄抗体的制备及性能分析

为了研制鸡源抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）卵黄抗体（IgY）,利用WSSV毒株及其衣壳蛋白VP28制备成2种不同的疫苗,并分别免疫接种健康蛋鸡群,使鸡群产生不同的IgY,经病毒中和试验证实,2种IgY均有明显的抗WSSV效果,其中WSSV粗提液1∶1000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY对南美白对虾的保护率为61.7%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为48.3%;而WSSV粗提液1∶10000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为85.0%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为75.0%.