甘蔗GA20氧化酶基因片段克隆及序列分析

以甘蔗茎尖为材料,根据其它植物的GA20氧化酶基因(GA20-oxidase)氨基酸保守区,设计一对简并引物.通过RT-PCR扩增得出1条约740 bp大小的DNA片段.将其克隆至pMD18-T载体上,而后对重组克隆进行测序,结果表明所获得的甘蔗GA20氧化酶基因片段由740碱基组成,编码246个氨基酸.该基因片段具有其它植物GA20氧化酶基因中存在的保守区:同时,与多种单子叶植物的GA20氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性在80%和75%以上.聚类分析显示,甘蔗和玉米最先聚类,推测在进化上具有较近的亲缘关系,其次与高梁、结缕草聚类,然后再与水稻聚类,其中进化关系最远的是簇毛麦和小麦.     

甘蔗铁氧还蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以甘蔗叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因的cDNA,构建到pMD18-T载体后进行序列测定和序列分析.结果表明:①克隆得到的cDNA片段长度为688 bp,包含甘蔗Fd基因完整的开放读码框,编码151个氨基酸,其中酸性氨基酸残基较多,76～101的氨基酸序列高度保守;②...     

甘蔗ShSUT4基因及其5＇侧翼序列的克隆与序列分析

以甘蔗品种FN28为材料,首次克隆甘蔗ShSUT4基因。测序结果表明,该基因约为4.8 kb,包含5个外显子和4个内含子,并包括完整的开放阅读框。该基因5＇侧翼序列长度约为1.8 kb。采用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明,该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box、CAAT-box等,还含有一些顺式作用元件如光响应元件、MYB结合位点、ABRE响应元件等,表明甘蔗ShSUT4基因的表达可能受光照、MYB和ABRE等的调控。     

木薯转化酶抑制子MeINH3基因的克隆及生物信息学分析

转化酶抑制子调控转化酶的活性,在植物的糖代谢过程中具有重要作用。为了研究木薯的转化酶抑制子,本实验利用木薯基因组数据库分析及RT-PCR方法,从木薯中分离了1个木薯转化酶抑制子MeINH3的cDNA序列。MeINH3序列长度为564 bp,包含528 bp的完整开放阅读框,编码127个氨基酸,N端有16个氨基酸残基的信号肽,4个保守的半胱氨酸残基可形成两个二硫桥。亚细胞定位预测表明,MeINH3蛋白定位于胞外。根据生物信息学分析结果,推测其可能抑制木薯细胞壁转化酶活性。     

菠萝酸性转化酶基因家族初步生物信息学及表达分析

酸性转化酶（acid invertase, AIN）在菠萝采后蔗糖降解过程中起着重要作用,基于菠萝全基因组数据库,预测菠萝AIN家族基因并进行生物信息学分析,解析其在采后菠萝不同贮藏温度下的表达变化情况,为阐明AIN基因在采后菠萝果实贮藏特性中的作用奠定基础。以水稻AIN家族基因为探针,在菠萝全基因组中鉴定到2个菠萝细胞壁酸性转化酶基因（cell wall acid invertase, CWIN）和2个液泡酸性转化酶基因（vacuolar acid invertase, VIN）,分别命名为AcCWIN1、AcCWIN2、AcVIN1、AcVIN2,设计编码区引物进行测序验证,并进行生物信息学分析。进化分析结果表明,AcCWIN1、AcCWIN2和AcVIN1、AcVIN2蛋白分别归于细胞壁酸性转化酶和液泡酸性转化酶2个进化支上,且均属于糖基水解酶家族GH32,基因结构、保守域和保守基序均一致。荧光定量分析结果表明,菠萝果肉中AcVIN1和AcVIN2在果实采后贮藏过程中表达量升高,且AcVIN1在发生黑心病的部位大量表达,而AcCWIN1和AcCWIN2在采后贮藏过程中表达量逐渐降低,且随着贮藏温度的升高其表达量降低,预示AcVIN1、AcVIN2较AcCWIN1、AcCWIN2在菠萝采后蔗糖降解和黑心病的发生方面发挥着更为重要的作用。     

甜菜BvCK2基因全长cDNA的克隆和序列分析

甜菜M14品系在细胞胚胎学和遗传学特征上具有鲜明的无融合生殖现象.为了寻找在这一特殊的生殖过程中的相关基因及其调控作用,实验通过同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE)的方法,首次从甜菜M14品系中克隆了与生殖相关的基因ByCK2(Beta vulgaris casein kinase 2)的全长cDNA序列,长度为1 501 bp,开放阅读框为1002 bp,编码333个氨基酸.根据氨基酸序列计算蛋白分子量为39.28kDa,pI=8.16.同源比对表明,ByCK2与烟草CK2(GenBank No.A1437635)的相似度为64.22%,与百合CK2(GenBank No.AF517838)的相似度为65.18%.通过细胞内定位分析,BvCK2所编码的蛋白主要存在于细胞核中.     

番木瓜果实膨胀素基因部分序列的克隆及分析

膨胀素(Expansin)是一类存在于植物细胞壁上,并能快速缓冲张力,使植物细胞壁松驰的蛋白质。以成熟番木瓜果实总RNA反转录得到的cDNA为模板,设计简并引物进行PCR,得到1个大小为531bp的基因片段,编码177个氨基酸,并存在expansin的保守区域,命名为Cp-EXP1。番木瓜expansin的成功克隆为研究番木瓜的生长发育以及其品种的改良等打下了良好的基础。     

花生△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

根据已报道的△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD)的氨基酸保守序列设计引物进行RT-PCR扩增,得到花生△12-脂肪酸脱氢酶基因881bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE),向两端延伸得到1410bp的花生△12-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个长1140bp、编码379个氨基酸残基的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为43kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白(membrance-anchored protein)重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些特性表明所获得的序列为△12-脂肪酸脱氢酶基因。     

甘蔗镰孢菌FsANT基因的克隆及表达模式分析

甘蔗是我国主要的糖料作物,是生产蔗糖最主要的原料,甘蔗生产过程中受到的病虫害威胁给蔗糖产业造成了严重的损失。甘蔗镰孢菌（Fusarium sacchari）引起的梢腐病是一种真菌性病害,严重影响甘蔗作物生产。镰孢菌致病基因的研究对于梢腐病的防治具有重要意义。腺苷酸转移酶（adenine nucleotide translocase, ANT）介导线粒体与细胞质基质之间ADP/ATP的交换,在真核细胞能量代谢中发挥重要作用,与细胞的生长、发育和凋亡密切相关。本研究克隆获得了长936 bp具有完整开放阅读框（open reading frame, ORF）的甘蔗镰孢菌ANT基因序列,命名为FsANT,其编码311个氨基酸,并且与小麦条锈菌病原菌ANT蛋白和小麦白粉病病原菌ANT序列相似性较高。蛋白软件分析显示,该基因编码的蛋白为稳定的疏水蛋白,含有5个跨膜结构,一个ADP/ATP transporter结构域,有3个同源重复的MCF基序,与粒体转运蛋白家族（mitochondrial carrier family,MCF）的基本结构特点相吻合。软件预测分析发现FsANT基因可能定位在线粒体。qRT-PCR结果显示,FsANT基因在菌丝生长时期的表达相对稳定无显著差异;在与甘蔗互作过程的表达模式表现为：接种后12 h该基因开始上调表达,24 h表达量显著升高,72 h达到表达高峰。推测FsANT基因的表达不仅与甘蔗镰孢菌细胞的生长相关,同时可能参与F. sacchari与甘蔗的互作过程,且主要在侵染后期发挥功能。研究病原菌生长保守基因为甘蔗抗梢腐病育种提供新思路。     

龙眼体胚Myb转录因子基因的克隆及序列分析

以龙眼同步化调控的鱼雷形胚为材料,设计特异上下游引物,采用RT-PCR法,获得了797 bp的基因序列。通过NC-BI的BLAST软件进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性搜索及相似度分析,结果表明,所获得的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列与其他物种的Myb转录因子有较高的同源性,推断该基因序列属于龙眼Myb转录因子基因。已在GenBank登录,登录号为HQ661039。     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

早钟6号枇杷两个ETR基因成员的克隆及序列分析

以早钟6号枇杷的试管苗叶片为材料,采用同源克隆方法得到乙烯受体基因ETR的两个成员Ej-ETR1a和Ej-ETR2a的cDNA全长序列,在GenBank上的登录号为JX307084和JX307089.Ej-ETR1a序列全长2771 bp,包括227bp 5’-UTR、2226 bp ORF及318 bp 3’-UTR; Ej-ETR2a序列全长2594 bp,包含2226 bp ORF及366 bp 3’-UTR.Ej-ETR1a、Ej-ETR2a均编码741个氨基酸,且氨基酸序列具有95.28％的相似性.生物学信息分析表明:枇杷Ej-ETR1a和Ej-ETR2a均属于乙烯受体ETR1亚家族,为一个具有跨膜结构的非分泌蛋白,具有疏水性.2个ETR成员的克隆为进一步研究枇杷乙烯受体作用机制奠定了基础.     

巴西橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因的克隆及序列分析

根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3’-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbLEA14基因的全长cDNA序列,其ORF长456 bp,编码151个氨基酸,预测HbLEA14蛋白分子量为16.58 ku,等电点为5.10。同源性比对显示,HbLEA14与蓖麻RcLEA14、乳浆大戟EeLEA14、陆地棉GhLEA14、大豆GmLEA14、拟南芥AtLEA14、番茄SlER5的同源性分别为88%、80%、75%、73%、65%和61%,属于非典型第2组LEA蛋白。RT-PCR结果显示,死皮植株胶乳中HbLEA14的表达量明显高于健康树。     

枇杷鲨烯合酶(Squalene synthase)基因的克隆及序列分析

鲨烯合酶(SQS)是枇杷三萜酸生物合成过程中的关键酶。以枇杷(Eriobotrya japonica L.)悬浮培养细胞为材料,采用RT-PCR和RACE方法分离得到枇杷鲨烯合酶Ej-SQS(Squalene synthase)基因的cDNA全长序列(GenBank,JQ294055),共1 775 bp,包含了5′非编码区为97 bp,开放阅读框为1 239 bp,3′非编码区为439 bp。该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含412个氨基酸)与其它植物SQS具有79%~94%同源性,包含Trans_IPPS_HH保守结构域,可能属于Isoprenoid Biosynthesis enzymes,Class 1家族。为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。     

巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌Slt2类MAPK同源基因CMP1的克隆与序列分析

根据几种丝状真菌Slt2类MAPK的保守氨基酸序列设计简并引物,从巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌[Corynespora cassiicola(Berk.Curt.)Wei]中扩增出MAPK同源基因的部分片段,再利用染色体步移法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK编码基因的全长序列,命名为CMP1(GenBank Accession No.GU321364)。序列分析表明,该基因含有5个外显子和4个内含子,编码417个氨基酸的多肽,推测分子量为47.5 ku,等电点为5.57。CMP1含有一个参与双重磷酸化作用的MAPK蛋白激活域(TEY),其氨基酸序列与丝状真菌的MAPK,AAslt2和MAP-kinase等高度同源。系统聚类结果显示,该基因与白菜黑斑病菌(Alternaria brassicicola)、细交链格孢菌(A.alternata)和玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)的Slt2类MAPK基因具有较高的同源性。Southern杂交分析表明,CMP1基因在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌基因组中以单拷贝形式存在。     

巴西橡胶树HbRPS6-2基因的克隆与生物信息学分析

从巴西橡胶树甲基化过滤文库中筛选到一个与RPS6同源性较高的基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,利用RACE进行特异片段的5’和3’扩增,获得长度为1 327 bp的HbRPS6-2基因克隆。生物信息学分析表明,该基因包含483 bp的开放阅读框,5’非翻译区为357 bp,3’非翻译区为475 bp,编码161个氨基酸。在HbRPS6-2氨基酸序列中没有预测到信号肽和跨膜区,二级结构分析表明其属于混合型蛋白。HbRPS6-2在N端前18个氨基酸区域内有一个较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对15个RPS6系统进化分析发现,巴西橡胶树的RPS6-2基因与多杀性巴氏杆菌的RPS6基因亲缘关系最近,而与拟南芥和玉米等亲缘关系相对较远。     

多花水仙WRKY转录因子的克隆与序列分析

以‘黄花水仙2号’和‘金盏银台’为材料,根据课题组已克隆出的多花水仙转录因子WRKY基因片段设计特异引物,通过RACE技术分别从2个水仙品种中克隆出2个不同的WRKY基因,命名为Nt WRKY40a和Nt WRKY40b,开放阅读框(ORF)长度分别为945和951个碱基。序列分析结果表明,两序列均含有WRKYGQK保守结构域;‘黄花水仙2号’与‘金盏银台’、拟南芥、葡萄、青蒿、小麦和粳稻的相似系数分别为:97.27%、45%、43%、47%、41%和43%。Real-time PCR分析结果表明:WRKY基因在花瓣和副冠开花过程中的表达量发生变化,说明其可能参与多花水仙花朵的衰老过程。     

巴西橡胶树中碱性转化酶HbNINa基因的克隆和表达模式分析

检索橡胶树EST和基因组数据库,发现了1个在叶片中高丰度表达的中碱性转化酶基因.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因的cDNA和基因组序列,命名为Hb NINa.序列分析结果显示,HbNINa基因cDNA序列的编码区(CDS)序列长度为1 719 bp,对应的基因组序列为3 696 bp.序列分析表明,该基因编码571个氨基酸多肽,推测其分子量大小为65.7 ku,等电点为6.36.HbNINa蛋白包含植物中碱性转化酶的全部保守结构域.基因组结构分析显示Hb NINa基因包含4个外显子和3个内含子.QPCR分析结果表明,HbNINa基因在在胶乳中表达水平极低,而在其他组织如树皮、树叶和雌花中的表达丰度相对较高.在叶片发育过程中,Hb NINa在叶片发育的初期高丰度表达,推测HbNINa可能参与叶片蔗糖利用,进而在橡胶树叶片发育过程中起重要作用.     

节节麦pbf基因的克隆、序列分析及原核表达

醇溶蛋白盒结合因子(prolamin-box binding factor,PBF)通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒PBF对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据,进而为小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源,利用特异引物组合pbfF1/pbf R1分别从两份节节麦(AS90、AS2386)中克隆出pbf基因后进行序列分析,并进一步构建pbf基因的原核表达体系。结果表明,从两份节节麦中克隆得到了2个不同类型的pbf基因(GenBank登录号分别为KJ544771和KJ544772),其中来源于AS2386的KJ544772与来源于普通六倍体小麦的1个pbf基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表明,KJ544771和KJ544772所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白,具有典型的DOF蛋白结构域。与其他远缘物种来源的PBF比对结果表明,该类蛋白在NLS核心、DOF结构域及Ser铰链区相对保守,而在C-端调控区变异较大,说明PBF蛋白具有种属特异性。同时,系统演化树显示,来源于节节麦AS2386的pbf基因与迄今已知的全部普通小麦的pbf基因具有高度的相似性,因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的普通六倍体小麦的形成。此外,本研究成功构建了pbf基因的原核表达体系,可为后续功能验证的开展奠定基础。     

粗山羊草新型硬度等位基因的克隆及分析

小麦籽粒硬度是其最为重要的品质性状之一,现已发现控制小麦籽粒硬度的主效基因是Pina和Pinb。为了丰富籽粒硬度新型等位基因,根据已报道的小麦Pina和Pinb基因的保守序列,设计了2对特异性引物,对粗山羊草（Aegilops tauschii)进行Pina和Pinb基因的PCR扩增、克隆及序列分析。结果表明,本研究共得到2个新型Pina等位基因和3个新型Pinb等位基因,核酸序列长度均为447 bp,编码148个氨基酸残基,具有麦类作物PINA和PINB蛋白所特有的色氨酸结构域：WRWWKWWK和WPTKWWK。与已知的Pina和Pinb基因序列相比较,这些基因含有多个SNP变异位点,丰富了小麦籽粒硬度改良的遗传资源。[JP]