中国2种橡胶树炭疽病菌对咪鲜胺敏感性比较

炭疽病是橡胶树上一种重要的叶部病害,主要病原有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌。为了解中国各植胶区炭疽菌对咪鲜胺的敏感性,采用生长速率法室内测定来自海南、云南、广东和广西4省(区)22株橡胶树胶孢炭疽病菌和15株尖孢炭疽菌对咪鲜胺的敏感性。结果表明:供试的37株橡胶炭疽病菌菌株对咪鲜胺的EC_(50)值为0.022 0~0.272 1 mg/L,平均为(0.061 7±0.055 4)mg/L,EC_(50)最大值是最小值的12.5倍。其中89.2%参试菌株的EC_(50)值介于0~0.100 0 mg/L。根据成组t检验分析结果表明,目前中国4个植胶区的2种橡胶炭疽病菌对咪鲜胺敏感性无明显差异。除了来自海南和云南地区的尖孢炭疽菌有显著性差异外,其他来自不同省份的胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌对咪鲜胺敏感性均无明显差异。研究显示中国橡胶炭疽菌对咪鲜胺仍具有较高的敏感性,但菌株间敏感性有一定的差异,存在一定的潜在抗性风险。     

橡胶树炭疽病菌的RAPD指纹分析

利用9条10碱基的随机引物,在分子水平上对来自海南、云南、广东的16株橡胶树炭疽病菌菌株的遗传变异程度进行RAPD指纹分析。结果表明,16株菌株被聚为3个RAPD指纹组;RAPD指纹组与菌株的地理来源有明显的相关性;而将病原菌接种于橡胶树品系PR107,所得到的病情指数与其RAPD指纹聚类组间没有明显的相关性。      

橡胶树胶孢炭疽病菌致病相关基因CgATG8的功能分析

ATG8是病原真菌中细胞自噬过程中的重要基因,并参与致病过程。基于橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组数据库,采用PCR和RT-PCR扩增得到橡胶树胶孢炭疽病菌的CgATG8基因并进行序列分析。采用Split-Marker Recombination法获得该基因的敲除转化子。表型分析结果表明,缺失该基因后,橡胶树胶孢炭疽病菌的致病力丧失,产孢能力、孢子萌发率、附着胞形成率和膨压均降低,而且孢子萌发和附着胞的形成延迟。     

中国橡胶树苗圃2种炭疽病菌分子鉴定及分布分析

根据胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌特异引物对,对采自中国云南、海南、广东和广西植胶区的138株炭疽病菌进行分子鉴定。结果显示:138株炭疽菌中鉴定为胶孢炭疽菌的有100株,占总测定株数的72.46%,尖孢炭疽菌的有38株,占总测定株数的27.54%。其中海南、云南和广东橡胶苗圃中胶孢炭疽菌占所分析菌株总数比例分别为81.82%(54/66)、60.0%(15/25)和77.27%(17/22),而广西3个橡胶苗圃中的2个苗圃地尖孢炭疽和胶孢炭疽病菌各占一半。总体来看,国内橡胶树苗圃地炭疽病病原菌仍以胶孢炭疽菌为主,部分苗圃同时存在胶孢和尖孢炭疽菌的危害。     

巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌Hog1同源基因的克隆和序列分析

为了解MAPK信号途径中hog1基因在多主棒孢病菌(Corynespora cassiicola)侵染橡胶树过程中的作用,根据几种丝状真菌的hog1基因设计简并引物,采用PCR和RT-PCR的方法扩增巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌CC01的hog1基因,并对其扩增产物进行测序,同时还对该基因编码的蛋白进行氨基酸序列比对和系统发育分析.结果表明:该基因开放阅读框架为915 bp,编码304个氨基酸残基,包含6个内含子;该基因的氨基酸序列与小麦黄斑叶枯病菌(Pyrenophora tritici)MAPK HOG1(XP_001935555.1)、谷子弯孢病菌(Cochliobolus lunatus)MAP kinase ClK1(AFJ42499.1)等高度同源.     

芒果炭疽病菌环境pH信号调控基因PalF的克隆与分析

通过本地查找胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)橡胶菌株全基因组测序数据,获得PalF基因的序列信息。利用同源克隆的方法扩增胶孢炭疽病菌芒果菌株PalF基因,获得片段大小为2 369 bp的目的基因片段。对该基因序列进行分析发现,该片段含有完整的开放式阅读框,与橡胶炭疽菌PalF基因的序列同源性达100%。用RT-PCR的方法获得PalF基因的cDNA序列,序列进行分析发现该基因全长为2 310 bp,其中含有1个大小为59 bp的内含子,推测编码769个氨基酸。对PalF基因的氨基酸序列进行推测保守结构域分析可知PalF蛋白中含有Arrestin-C保守结构域,推测该基因参与环境pH感应信号转导途径(Ambient pH-sensing signal transduetion pathway)的调控,为进一步研究该基因在环境pH感应信号转导途径中的作用奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌esyn1基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法扩增了香蕉枯萎病菌恩镰孢菌素合成酶基因esyn1的cDNA片段,测序结果表明,esyn1基因核苷酸序列阅读框架全长546 bp。核苷酸序列分析显示该基因片段编码181个氨基酸,推测分子量为19.9 ku,等电点为5.06。氨基酸序列比对结果表明,它与半裸镰刀菌、层出镰刀菌、拟枝孢镰刀菌esyn1基因的氨基酸序列的相似性分别为96%、94%、77%。     

芒果炭疽病菌多重巢式PCR检测体系建立及田间快速检测

以芒果炭疽病病原菌rDNA-ITS为靶标,建立并完善多重巢式PCR检测技术,结合常规形态学特征分析,对中国华南地区10个田间样品进行检测分析.结果表明:该技术特异性强、灵敏度达2fg/μL、重复性强、可操作性强,能同时检测、区分2种病原菌,能够应用于田间炭疽病害的检测工作,也是常规形态学鉴定的补充.利用该技术检测到田间芒果炭疽病存在胶孢、尖孢2种病原菌的复合侵染,该结果为后续开展有效防控措施提供理论指导和技术支撑.     

橡胶树炭疽菌生物学和侵染特性研究

橡胶树炭疽病是危害我国橡胶树的一种重要叶病病害,致病菌为胶孢炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｉｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ（ｐｅｎ２）Ｓａｃｃ）。对其生物学特性研究结果表明,在２８℃下,有利于菌丝体生长,产孢和孢子萌发。最适合菌丝体生长的ｐＨ值为６。黑暗下有利于孢子萌发和菌丝体生长,但产孢则不如在光照条件下。在１００％相对湿度下孢子萌发率最高。在葡萄糖,橡胶叶汁和琼脂胶等营养液中,孢子萌发     

橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因HbLEA1的克隆和表达分析

胚胎晚期丰富蛋白（LEA）是与植物抗逆反应相关的一类重要蛋白。本研究克隆了橡胶树LEA家族一个新基因的全长cDNA序列,命名为HbLEA1。该cDNA全长1 183 bp,其中5'UTR区60 bp,3'UTR区154 bp,CDS区969 bp,共编码322个氨基酸,分子量大小为36 ku,等电点4.84,含有LEA-2和WHy（Water Stress and Hypersensitive response）结构域,属于LEA_2类LEA蛋白。组织表达分析结果表明,HbLEA1在种子中表达量最高,其次是胶乳和稳定叶,在芽中的表达量最低。在未开割树的胶乳中,机械伤害和割胶处理均明显下调HbLEA1表达。在橡胶树幼苗中,低温胁迫处理后该基因在叶片、树皮和根中的表达呈上升趋势,而在高温和干旱胁迫中其表达变化并不明显。结果显示,HbLEA1基因可能参与橡胶树的胁迫应答和胶乳代谢调控。     

国内橡胶树尖孢炭疽复合种种间分子系统发育及生物学特性分析

为明确国内橡胶树尖孢炭疽复合种内不同种的生物学特性及种间差异情况,评价了4个代表性菌株（Colletotrichum bannanense YNML52,C. laticiphilum YNJH17109,C. australisinense GX1655,YNJP162）对不同碳源、氮源的利用情况,以及在不同温度、pH、水活度下的生长情况,并评价了这些菌株对橡胶不同品种和不同作物的致病性。结果表明：供试菌株在碳源、氮源利用,适宜生长温度、致死温度、pH和水分活度等方面均存在显著差异;致病性分析表明,供试菌株的致病谱也存在显著差异,YNML52的寄主范围较窄,具有很强的寄主专化性。通过评价生态因子对橡胶树炭疽病病原菌生物学特性的影响,为深入了解橡胶病害发生规律和制定有效防控措施提供指导依据。     

橡胶树尖孢炭疽菌分子检测及遗传多态性分析

根据GeneBank中Colletotrichum属的20个种的ITS序列,比较设计出1对引物CAF53/CAR356(CAF53 5’-GGG CAG GGG AAG CCT CTC G-3’;CAR356 5’-AGC GGT GCT TGA GGG TTG-3’);该引物可以扩增出1条303 bp的尖孢炭疽菌特异性DNA条带。并利用ISSR和RAPD分子标记技术对从海南、广东、广西和云南等垦区橡胶树上收集的21个尖孢炭疽菌株进行遗传多态性分析,以杧果上分离的尖孢作为参照菌株进行了聚类分析。结果表明,RAPD的平均遗传相似系数为0.8,ISSR的平均遗传相似系数为0.7,2种分子标记的平均遗传相似系数基本一致,均可揭示尖孢炭疽病菌的遗传多态性;2种分子标记产生的聚类分析结果存在一定差异;ISSR和RAPD类群与菌株的地理来源均不存在相关性。     

橡胶树类萌发素蛋白基因HbGLP01的克隆及其表达分析

类萌发素蛋白(GLPs)是一类重要的胁迫响应蛋白,参与植物的多种生理调控过程。试验前期通过cDNA-AFLP技术,从橡胶树转录组中筛选到一个与麻风树JcGLP(XM_012225699.1)高度同源的差异表达片段。在此基础上,通过基因预测和PCR扩增克隆到一个GLPs类基因HbGLP01。该基因包含2个外显子和1个内含子,cDNA全长696nt,编码231个氨基酸,预测蛋白分子量和等电点分别为24.8ku和5.54。同源比对表明,该蛋白与麻风树JcGLP1-13蛋白的同源性最高,达到81%。聚类分析研究表明,该蛋白与JcGLP1-13、胡杨PeGLP1-13及三角叶杨PtGLP等聚为一个分支。qRT-PCR分析发现,多主棒孢病菌侵染能诱导橡胶树HbGLP01基因的上调表达,其中高抗棒孢霉落叶病品种IAN873在侵染后24h时表达量达到峰值,高感品种PR107在48h后达到峰值,而且在IAN873中的表达峰值显著高于PR107。     

海南橡胶树炭疽菌Colletotrichum siamense和C. fructicola的鉴定及系统发育分析

橡胶树炭疽病是橡胶树上一种重要叶部病害,胶孢炭疽菌复合群为我国橡胶树炭疽病的重要病原菌,但至今未知具体是由复合群下哪些种引起。为了对前期已经确定为属于胶孢炭疽菌复合群的来自海南13株胶孢炭疽菌进行进一步种属鉴定,本研究继续克隆了供试菌株的Ap Mat和GS 2个基因,并分别采用Ap MAT单基因、GS/Ap MAT双基因和采用ITS/CHS-1/GAPDH/ACT/GS/Ap MAT 6个基因的多基因拼接序列分别进行分析。结果表明:无论是采用Ap Mat单基因、GS/Ap Mat双基因还是6基因拼接序列,都能将供试的13株炭疽菌分属胶孢炭疽菌复合群下的C.siamense和C.fructicola 2个种。该结果说明危害海南橡胶树炭疽病的胶孢炭疽菌复合群主要有C.siamense和C.fructicola 2个种,同时也说明了利用Ap MAT基因和GS/Ap MAT双基因能对胶孢炭疽菌复合群下的种进行鉴定。      

胶孢炭疽菌侵染橡胶树叶片染色方法的建立及显微观察

本研究建立了一种橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,通过显微观察明确胶孢炭疽菌在橡胶树叶片中的侵染结构,为橡胶树炭疽病的预测预报提供理论依据。在脱色剂（0.15%三氯乙酸乙醇溶液∶氯仿=5∶1）处理12 h,1%刚果红染色剂抽滤染色3 h的条件下,能清晰观察到胶孢炭疽菌在橡胶树叶片上的发育进程和侵染结构。结果表明,在28 ℃、100%相对湿度培养条件下,接种橡胶树淡绿期叶片2~6 h为分生孢子萌发高峰期,12 h后分生孢子萌发率大于85%;8~12 h为附着胞形成高峰期,接种12 h约75%的芽管顶端产生附着胞,少数附着胞中央部位开始形成侵染钉;24 h为侵染钉形成高峰期,同时分生孢子萌发形成多个芽管;36 h时附着胞顶端再次萌发产生次级附着胞,从而进一步侵染周围细胞,叶片出现零星病斑;48 h时芽管不断分支异化成菌丝并产生次级分生孢子,叶片出现大量典型的炭疽病病斑;72 h后菌丝在叶片表面纵横扩展,随机分支,逐步形成网状分布。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,侵染部位组织出现褐色坏死病斑。本研究建立了一种着色效果好,简便易行,经济有效的橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,进一步明确了胶孢炭疽菌的侵染结构。     

橡胶树红根病病原菌rDNA-ITS序列鉴定

为了更好地对橡胶树红根病病原菌进行鉴定,从海南省和云南省发病严重的胶园采集病害样本、分离得到12个灵芝属菌株,并对其rDNA-ITS序列绘制Ganoderma属系统发育树。结果表明,采集得到的12个菌株中有11个鉴定为Ganoderma philippii、1个鉴定为G.gibbosum。     

橡胶树枝条内生真菌的分离及其拮抗性的测定

经过严格的表面消毒程序,从橡胶树枝条中分离到18株内生真菌,并对其进行初步鉴定.结果表明,这18株内生真菌分别归属于2个目,2个科,7个属,其优势菌群为无孢菌群(Mycelia Sterilia).通过温度测定,确定橡胶树内生真菌最适生长温度为25～28℃:采用平板对峙培养法,研究内生真菌对香蕉枯萎病菌(Fusarum pxysporum f.sp.cubense)和橡胶炭疽病菌(Colletorichum gloeosporioides Penz.Sace)的抑菌作用.结果表明,ITBB2-2对两种植物病原菌的拮抗作用最好.ITBBBB2-10和ITBB2-15次之,ITBB2-3对香蕉枯萎病菌拮抗作用明显而对橡胶炭疽病菌拮抗作用不明显,其它内生真菌对两种植物病原菌无拮抗作用或不明显.     

橡胶树炭疽病生防内生菌的分离鉴定及抑菌作用研究

目前化学农药的缺点日益突显,研发环保的生防菌剂是当前绿色安全的一种方法,筛选具有抑制橡胶树炭疽病的生防菌株,为研发新型生防菌剂储备资源。本文采用组织培养法分离纯化橡胶树内生菌,平板对峙筛选拮抗菌株;通过菌株培养特征、生理生化、根据16S rRNA和gyrA基因序列构建系统发育树确定其分类地位;采用平板对峙法研究内生菌株的抗菌持久性、稳定性、广谱性;采用牛津杯法研究拮抗内生菌对杀菌剂的敏感性。从橡胶树健康的根组织中分离得到4株对橡胶树炭疽病具有抑制作用的细菌（Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4）,系统发育树分析结果显示这4株细菌与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）亲缘关系很近,且培养性状和生理生化特征也与解淀粉芽孢杆菌相似。这4株内生菌的抗菌持久性强,抗菌稳定性好;对尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）DFMP1E和MLZZP3、小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）MF375898均有较强的抑菌能力,对茄类镰刀菌（Fusarium solani）XJ160901的抑制作用较弱;对多菌灵、异菌脲、百菌清、苯醚甲环唑4种杀菌剂均不敏感,有望开发为生防菌剂。