橡胶树花药愈伤组织继代培养与胚状体发生能力研究

利用橡胶树花药愈伤组织进行继代培养与胚状体诱导,结果表明,在诱导愈伤组织、继代培养和分化胚状体中MS培养基稍优于改良MS培养基;以继代1代的愈伤组织胚状体的诱导率最高,分别达到70．8％和67．5％;在继代0代、2代和3代之间差异达到极显著,在继代4代时差异达到显著,其他继代次数之间差异不显著。在继代8代后,两种培养基的诱导率逐渐升高,分别达到44．6％和35．3％。     

巴西橡胶树胚性组织长期继代保存及增殖技术

在橡胶树花药组织培养过程中,利用胚诱导过程后期产生的不同生理阶段的胚性组织进行继代增殖和成胚性研究,试验表明:1)心形胚及前期的胚性组织能继代增殖,多次继代增殖后的组织,经胚诱导过程1~3个月能成倍形成鱼雷胚,大大提高了橡胶花药组培的成胚率;2)胚性愈伤是适合长期继代和增殖保存的最好材料,经2a的继代保存增殖率和成胚率不下降,其最大继代增殖能力还在测试中;3)在继代增殖培养基上,胚性组织按原有形态增殖,通过选取同一生理阶段的胚性组织进行继代,可控制体胚发育过程,促进体胚发育同步进行。     

枇杷花药胚状体诱导条件的优化

以‘大五星’枇杷花药为外植体,研究小孢子发育时期、低温处理及植物生长调节剂对花药愈伤组织诱导及胚状体发生的影响。结果表明：枇杷小孢子发育时期与花蕾横径存在对应关系,横径为4.68～5.28 mm的枇杷花蕾处于单核靠边期,此时期的小孢子胚状体诱导率最高,为25.05％;经4 ℃低温处理2 d的花药愈伤组织诱导率最高,达69.93％;花药愈伤组织诱导的最适培养基是MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2.0 mg/L,愈伤组织诱导率为78.22％;枇杷花药愈伤组织诱导胚状体的最适培养基为MS+ZT 0.05 mg/L+NAA 0.01 mg/L+IBA 0.05 mg/L,胚状体诱导率为25.56％。     

橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织的诱导及其植株再生

以高产优质橡胶品种热研88-13的幼嫩种子内珠被为外植体材料,对愈伤组织诱导培养基和继代培养基中的影响因素如植物生长调节剂的种类和浓度、钙离子浓度等进行了研究。经过连续6个月的继代选择培养,逐渐诱导出易碎的胚性愈伤组织,适宜的易碎胚性愈伤组织诱导培养基为:MH基本成分,添加0.5 mg/L KT,2.0 mg/L 2,4-D,11.0 mmol/L CaCl2,80.0 g/L蔗糖和2.0 g/L Phytagel。组织学切片证明长期继代培养的易碎胚性愈伤组织维持了胚性的状态。取继代培养2 a多的易碎胚性愈伤组织诱导体细胞胚的形成,得到了16 000多个体细胞胚。将这些胚进行进一步的转移培养,得到了115株再生植株。     

基因型对橡胶树胚状体遗传转化瞬时表达影响的研究

侵染后抗性胚状体诱导频率低是影响橡胶树遗传转化发展的主要原因,而橡胶树次生体胚发生体系具有体胚增殖效率及植株再生率高的优点。以3个综合性状优良的橡胶树无性系次生体细胞胚状体为受体,研究其对根癌农杆菌的耐侵染能力、GUS基因的瞬时表达情况,探讨不同无性系胚状体对农杆菌转化的反应。结果表明：3个无性系农杆菌污染情况无显著差异,长菌的外植体经无菌水和抗生素水洗涤3 d后即可恢复生长;侵染后每30个胚褐化了1.2～5个胚,占侵染总胚数的4.00%～16.67%,品种间褐化面积无显著差异;热研87-6-62的总蓝斑数显著高于其它2个无性系,平均每个胚染上14.29个蓝斑,热研7-33-97和PR107稍差,但每个胚也能分别染上8.14和8.72个蓝斑。因此3个无性系均可以胚状体作为遗传转化的受体。此结果对利用胚状体为受体改良橡胶树优良无性系奠定良好基础。     

适合全周期间作的橡胶树品种热垦628花药再生体系研究

在橡胶树体胚发生再生体系研究中,如何快速获得胚性愈伤组织是能否成功建立再生体系的关键。本研究基于课题组前期的研究基础,以橡胶树花药为外植体,通过正交试验设计方案研究了毒莠定、KT、6-BA、IAA四种激素的不同浓度组合对橡胶树花药胚性愈伤组织诱导的影响,结果表明：橡胶树花药愈伤组织诱导的最优组合培养基为MS基础培养基,硫胺素0.4 mg/L、天冬酰胺300 mg/L、水解酪蛋白100 mg/L、脯氨酸100 mg/L、精氨酸100 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、L-半胱氨酸-盐酸盐50 mg/L、蔗糖70 g/L、椰子水50 mL/L、植物凝胶2.2 g/L,并添加毒莠定浓度20 mg/L、KT浓度2 mg/L、6-BA浓度1 mg/L、IAA浓度0 mg/L,愈伤组织诱导率达73.3%～100%。所有处理在诱导愈伤组织25～28 d左右,愈伤组织达到快速增殖时期,对胚性愈伤组织的诱导起主要作用的是毒莠定浓度,其浓度在20～30 mg/L之间时,对胚性愈伤组织的诱导有促进作用。低浓度的毒莠定虽然也能诱导愈伤组织产生,但是这些愈伤组织几乎为无胚胎发生能力的非胚性愈伤组织。同时用获得...     

甘蔗胚性愈伤高效诱导系列研究Ⅰ.幼叶离体培养直接诱导胚性愈伤发生

以ROC22心叶为外植体,研究了取材部位、培养基蔗糖含量等因素对甘蔗胚性愈伤发生的影响,重点探讨了不同植物激素和生长调节剂组合的作用,建立了无需继代、直接诱导高质量甘蔗胚性愈伤发生的体系。结果表明:顶端生长点以上5~6 cm区段最内层3片心叶为最适外植体;MS+2,4-D 3.0 mg/L+Dicamba 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+DA-6 6.0 mg/L+CSN 4.0 mg/L+蔗糖40 g/L为最佳培养基;经28 d暗培养,心叶无需继代即可分化成为胚性愈伤,诱导率可达42.67%。所得胚性愈伤质量高、分化强,可用于甘蔗遗传转化研究。     

巴西橡胶树花药体胚发生类型及其培养条件的改良

橡胶树花药培养体胚发生率低及植株再生频率低是制约其组培苗工厂化生产的瓶颈。以热研7-33-97品系花药为外植体,研究橡胶树花药体细胞胚发育过程并对其体细胞胚进行系统分类,同时改良其培养条件。结果表明,完整的体胚发育过程是球形胚-心形胚-鱼雷胚-子叶胚,但有些心形胚不能进一步发育成鱼雷胚,在后继培养中会分化成畸形胚;体胚发生不具同步性,在鱼雷胚旁又长出次生胚。胶树花药体细胞胚共分9种类型,发现胶树花药体胚发生过程中产生连体胚现象,该类胚能正常发育成植株。不同胚状体培养条件对植株再生率的影响说明,暗培养诱导胚状体2个月后再转移至500 lx弱光照条件下培养10～15 d,然后再转移至出苗培养基培养,能够显著提高植株再生率。在诱导胚胎发生培养基中添加不同浓度的稀土,结果表明,稀土具有提高橡胶树花药体胚发生率的效果,其中以添加1 mg/L稀土培养效果最佳。     

小麦幼胚愈伤组织分化和继代分化特性的影响因素

为建立稳定、高效的小麦幼胚愈伤组织继代分化体系,以4个小麦品种为材料,对影响普通小麦幼胚愈伤组织分化和继代分化特性的因素进行了研究。结果表明,碳源、有机添加物、诱导和继代间隔时间及基因型对小麦幼胚愈伤组织的分化和继代分化特性有显著影响。1.5%蔗糖和1.5%麦芽糖配合使用,小麦幼胚愈伤组织分化和继代分化效率显著高于3%蔗糖和3%麦芽糖单独使用的分化效率;4种有机添加物对小麦幼胚愈伤组织分化和继代分化特性均有正向增加效应,其中,诱导培养基中分别添加500mg·L-1酸水解酪蛋白、250mg·L-1 L-谷氨酰胺和250mg·L-1 L-天门冬酰胺的正向效应显著,愈伤组织分化率分别比对照提高17.5%、15.2%和14.2%,继代3次后的愈伤组织分化率比对照显著提高了93.9%、73.6%和52.8%;诱导分化和继代诱导分化的时间是小麦幼胚愈伤组织分化和继代分化特性重要的影响因素之一,诱导15d和继代间隔15d的愈伤组织分化和继代分化率显著高于20d和25d,且随诱导和继代间隔时间的延长,愈伤组织分化率迅速下降;供试4种基因型材料的愈伤组织分化和继代分化特性有显著差异,供试品种千斤早和小偃22愈伤组织分化特性较好,扬麦12和扬麦18继代愈伤分化特性较好,愈伤组织分化和继代分化特性的表现无相关性。     

橡胶树体胚遗传转化中早代转化胚状体的PCR鉴定

橡胶树体胚遗传转化体系已成功建立,但抗性胚状体的循环增殖可获得大量抗性胚状体的同时,其后期的继代工作繁重.本文对橡胶树基因组DNA的CTAB提取方法进行了优化,同时筛选出了适合PCR检测的胚块重量.文中建立的胚块DNA的CTAB提取方法及筛选出的1～3mg重的胚块提取的DNA量均可满足早代胚状体PCR分析鉴定,且PCR鉴定结果与胚块的GUS染色结果吻合.该方法可用于橡胶树体胚遗传转化抗性胚状体早代筛选.     

铁兰体细胞胚的诱导及植株再生

以铁兰无菌苗为外植体,研究不同激素配比对铁兰胚性愈伤组织诱导及体细胞胚形成的影响,并对体细胞胚的发生过程进行形态学观察.结果表明:2,4-D对铁兰胚性愈伤组织的诱导具有重要作用,诱导铁兰胚性愈伤组织的最适2,4-D浓度为2.0 mg/L;胚性愈伤组织在含ABA的培养基上可分化形成体细胞胚.形态及解剖学观察表明,愈伤组织既可以产生于外植体的外层细胞,又可产生于外植体的深层细胞.体细胞胚的形态发生经历了与合子胚形态发生相似的阶段,即经过球形胚、子叶形胚等.胚经过萌发、芽的伸长和生根后形成再生植株.     

油棕体细胞胚的诱导和次生胚的增殖研究

油棕体细胞胚的诱导是油棕体胚发生技术体系中最关键的培养过程,通过建立油棕次生胚增殖培养方法可有效地实现油棕组培苗快速的增殖繁育。本研究通过系统的对油棕体细胞胚发生及次生胚再生途径中若干影响因子的比较研究,建立油棕体细胞胚和次生胚再生体系。结果表明：油棕体细胞胚再生体系在不同基因型的油棕品种内诱导率存在较大差别,其中植物外源激素二氯苯氧乙酸(2,4-D)对油棕胚诱导效果较好;油棕次生胚增殖在不同基因型的油棕品种内差异不显著,木本植物培养基(WPM)在油棕次生胚增殖中培养效果最好。     

番木瓜叶片、叶柄胚性愈伤组织的诱导及其体胚植株的发生

以“漳红”番木瓜组培苗的叶片和叶柄为外植体,在改良MS＋0．5mg／LKT＋1．0mg／L2,4-D＋0．5mg／L BA＋0．1mg／L NAA＋400mg／L Glu＋30g/L蔗糖的固体培养基上诱导出了胚性愈伤组织。其中,CⅡa型胚性愈伤在一定条件下能够继代增殖,并能向CⅡb型转变,CⅡb型胚性愈伤则容易发生体胚。采用两步生根法,将体胚再生植株先接种于1／2 MS＋0．5mg／L IBA＋1．0g/L AC＋30g／L蔗糖的固体培养基中暗培养7d后,转移至1／2 MS＋1．0g/L AC＋25μmol／L VB2＋30g/L蔗糖的固体培养基上光照培养,生根效果最好。移栽后,成活率可达45％以上。     

巴西橡胶树花药体细胞胚形成中乳管分化的研究

培育数量多、质量好的体细胞胚是当前巴西橡胶树花药组织培养的主要研究目标,而对于体细胞胚发育过程中是否有乳管分化目前尚不清楚。以不同发育阶段的正常体细胞胚以及不同形态的畸形胚为材料,对它们的乳管分化情况进行了研究。结果表明,球形胚、心形胚和鱼雷胚中都没有乳管分化,最早出现可辨识的乳管是早期子叶胚,而不同形态的畸形胚都有乳管分化。本研究为深入研究乳管分化的机制提供了基础。     

乙烯刺激橡胶树胶乳黄色体蛋白差异初析

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳中的黄色体作为乳管细胞的一种细胞器,其稳定性受乙烯刺激影响。该试验从蛋白差异角度,选取未开割胶树,应用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE),比较在乙烯刺激与未刺激条件下,黄色体蛋白的变化情况。结果表明,按蛋白表达量变化差异3倍及以上分析,胶树在乙烯刺激24h后,上调蛋白5个,下调蛋白2个;在乙烯刺激48h后,上调蛋白7个,下调蛋白1个;综合3个处理,先上调后下调的蛋白8个;先下调后上调的蛋白2个。应用质谱技术鉴定了其中部分差异表达蛋白,并进行初步功能分析,表明未开割橡胶树胶乳黄色体受乙烯刺激后,黄色体蛋白发生不同程度复杂变化,各组处理间变化明显。     

龙眼MEE70/MSI1基因DlMEE70-1a及其可变剪接体DlMEE70-1b的分离及其在体胚发生过程中的表达分析

MEE70/MSI1是拟南芥母性效应胚胎滞育基因,在植物胚胎发生过程中具有重要作用。采用RACE技术获得龙眼MEE70-1a(登录号KC492117)及其可变剪接体MEE70-1b(登录号KC492118)c DNA序列,克隆MSI1g DNA(登录号KC492126)序列。生物信息学分析预测Dl MEE70-1a和Dl MEE70-1b均为亲水不稳定的酸性蛋白,主要定位于过氧化物酶体和细胞核,各含有4和1个WD-repeat结构域。MEE70-1a和MEE70-1b在体细胞胚胎发生过程实时荧光定量PCR分析结果表明,Dl MEE70-1a和Dl MEE70-1b表达趋势以心形胚为界,除了Dl MEE70-1b的不完全胚型紧实结构(ICp EC)到球形胚(GE)阶段之间,都表现出先降后升的趋势;胚性愈伤组织(EC)时期两者表达量一致且最高;心形胚(HE)时期,两者表达量一致且最低,另Dl MEE70-1b在不完全胚性紧实结构(ICp EC)表达量与心形胚基本一致。这2个表达剂量是胚胎发生的重要保障,心形胚(HE)后,Dl MEE70-1a被再次激活转录促进胚胎正常发育。从Dl MEE70-1a和Dl MEE70-1b的理化性质、WD重复结构域数量、亚细胞定位以及表达量和趋势,可以推测Dl MEE70-1a需要Dl MEE70-1b的协同来调控龙眼胚胎发育。     

柱花草SgSPX1基因的克隆与表达分析

磷是植物生长和发育所必需的大量元素,参与重要的代谢活动,有效磷含量低已经成为酸性土壤上限制作物生长的重要因素之一。以磷高效的柱花草基因型TPRC2001-1为材料,通过同源克隆的方法,首次克隆到柱花草编码只含有SPX结构域蛋白的基因,SgSPX1。该基因cDNA全长1 324 bp,编码292个氨基酸残基,蛋白分子量为33 ku。定量PCR分析结果表明,低磷胁迫显著促进SgSPX1在柱花草根部的表达,表明该基因的表达受到低磷胁迫的调控,该研究的结果为进一步解析柱花草适应低磷胁迫的信号网络提供候选基因。     

石斛属植物DNA条形码序列的筛选

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种新的物种鉴定技术,COI序列已成功应用于动物的鉴定,但目前国际上还没有找到一个通用序列能鉴定所有植物物种。为筛选出适合于石斛属的DNA条形码序列,本文首先应用Mega 4.0软件分析了石斛属的ITS、matK、trnH-psbA、rbcL序列的特征,然后运用Wilcoxon秩和检验比较不同序列的种内和种间变异性,运用Taxon DNA软件评估这4个序列的barcoding gap。分析结果表明:ITS序列不仅种内变异和种间变异最大,而且有明显的barcoding gap,种内变异和种间变异重合较少,能较好地区分不同种类的石斛,可考虑作为石斛属DNA barcoding鉴定候选序列之一;matK、trnH-psbA和rbcL序列都不适合于石斛属DNA barcoding鉴定。在所分析的4个候选序列中,没有任何一个单一序列能完全鉴别出不同种类的石斛属植物。建议采用不同序列组合进行石斛属DNA barcoding鉴定。