沙田柚黄龙病病原16S rDNA片段的克隆与序列分析

采集田间表现斑驳症状的沙田柚叶脉,用CTAB法提取总DNA。根据柑橘黄龙病病原16S rDNA的核苷酸序列设计引物P1/P2,进行PCR扩增,获得1条大小为1 167 bp的片段。酶切分析显示,该片段可被切成大小分别约为640 bp和520 bp的2个片段。扩增产物经纯化,与pM D 18-T V ector连接,转化大肠杆菌(E scherich ia coli)DH 5α,筛选克隆重组子。对PCR产物进行测序及序列分析,结果表明,与柑橘黄龙病病原亚洲种16S rDNA的同源性为99%,与非洲种的同源性为97%,与美洲种的同源性为96%。认为,沙田柚的斑驳症状是由黄龙病病原引致的,称之为沙田柚黄龙病。该沙田柚黄龙病病原属于柑橘黄龙病病原亚洲种(L iberobacter as iaticus)中的一个成员。系统进化树分析显示,沙田柚黄龙病病原与中国柑橘黄龙病病原亲缘关系最近,推测是直接来自中国柑橘黄龙病病原。     

实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立

建立了一种检测Ⅱ型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2)的实时荧光PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)方法。用Primer Express2.0和Oligo6.0设计针对Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原基因簇中cps2I基因的引物和Taqman荧光探针。通过常规PCR方法扩增得到81 bp DNA片段，克隆到pMD18-T载体，测序表明得到的序列为目的基因片段。在Lightcycler荧光PCR仪上对Ⅱ型猪链球菌的扩增曲线表明，该实时荧光PCR具有良好的特异性，可成功地扩增Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌(S.suis)、大肠杆菌(Escherichia coli )、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、志贺氏菌(Shigella)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytoge)和空白对照都是阴性；该检测方法可达到检测10个细菌的灵敏度，反应过程仅需30 min完成；在两个不同时间检测同一浓度的菌液，每次做20个重复，2次检测所得的Ct (threshold，阈循环)值之间无统计学差异(P > 0.05)，方法稳定性好。该实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法可用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

狂犬病病毒为不分节段单链负股的RNA病毒,属弹状病毒科狂犬病病毒属。世界上几乎所有国家都有狂犬病发生,狂犬病病毒能够使所有温血动物发病致死,死亡率高达100%。本研究根据GenBank中的狂犬病病毒M基因序列,选择保守区域设计引物,通过对SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。结果显示,建立的狂犬病病毒实时荧光定量PCR方法,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,是开展狂犬病的临床检测的有力工具。     

利用实时荧光PCR进行植原体通用检测

本实验意在研究一种能够应用于植原体初筛,并且不易污染,易操作耗时短的通用方法.比较了已报道TaqMan实时荧光PCR与目前最常用巢式PCR在植原体通用检测中的应用.利用12种植原体感染植株及9种健康植物DNA测试了实时荧光PCR的特异性及通用性.所有植原体材料均获得强的荧光信号,为阳性结果,而健康植物DNA及空白对照均为阴性结果.实验结果证明该实时荧光PCR应用于植原体通用检测具有良好的特异性,相对灵敏度比巢式PCR高10倍,耗时短,操作方便,有效避免了PCR产物污染.实时荧光PCR为植原体病害的口岸检疫、田间监测及大量样品的通用检测提供了良好的技术支撑,是一种可能代替目前最常用巢式PCR的方法.     

实时荧光定量PCR检测胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及应用

研究建立检测胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的实时荧光定量PCR方法,并运用建立的检测方法对临床病料进行应用检测.根据GenBank报道的胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因3'端391 bp核苷酸保守序列,设计1对特异引物扩增117 bp核苷酸片段,建立检测APP的实时荧光定量PCR方法和标准曲线,并利用该方法对收集肺脏组织和人工感染组织材料进行APP核酸定量检测.结果表明,构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好敏感性、特异性、重复性和临床应用性.该方法的建立为APP的临床高效诊断和APP感染的发生、发展和转归研究提供了一种有效手段.     

乳制品中水牛乳成分的实时荧光PCR检测技术

水牛奶制品因其良好的营养功效备受国内外消费者的青睐,而在国内外,乳制品掺假行为,却常有发生.我国作为水牛奶酪等乳制品的进口国,迫切需要一种准确的水牛成分的检测方法,来避免这种掺假行为对我国的进出口贸易造成损失.根据水牛Bubalus bubalus)线粒体细胞色素b(Cytb)基因的保守序列,设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了水牛乳成分的实时荧光PCR检测方法.运用实时荧光PCR方法对5种乳水牛样品和47种常见的非水牛动植物样品进行检测,5种水牛乳样品均产生荧光信号,其余非水牛样品均不产生荧光信号,表明该检测方法具有特异性.该检测方法的重量检测灵敏度为0.01％水牛奶(W/W),DNA浓度检测灵敏度为0.001 ng/μL水牛DNA.对市售的水牛奶制品进行实际样品检测,结果表明,该方法能很好地检出水牛乳成分.本研究表明,该方法具有特异性好、灵敏度高的优点,可作为乳制品中水牛乳成分鉴别检测的有效方法.     

猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要: 根据GenBank已登录的猪附红细胞体（M.suis）推测的功能性蛋白基因ORF2序列设计引物和TaqMan荧光探针,以定量的10倍系列稀释含M.suis部分ORF2基因的T载体重组质粒（pGEX-T/M.suis）为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作了标准曲线,经对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了M.suis的TaqMan荧光定量PCR检测方法（Taqman FQ-PCR）;对所建立的FQ-PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性实验,并对疑似M.suis感染临床抗凝全血样品进行了检测应用。结果显示：标准曲线的曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;所建立的FQ-PCR方法检测灵敏度可达10个拷贝/μL,比对照常规PCR灵敏度高100倍;FQ-PCR方法特异性高,对pGEX-T/M.suis重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对8个对照细菌、病毒和寄生虫DNA扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEX-T/M.suis重组质粒分别重复扩增2次,重复结果良好;用该方法对24份临床疑似M.suis感染样品进行了应用检测,结果有20份样品为阳性,阳性检出率高于常规PCR方法。     

西尼罗病毒荧光定量PCR检测体系的建立及评价

本研究建立了一种实时荧光定量PCR快速核酸检测西尼罗病毒的方法。通过序列比对和blast分析，确定西尼罗病毒Caspid蛋白保守区基因为检测的目的基因，引物采用Primer Premier5.0软件进行设计。本研究建立的检测方法利用SYBR Green染料，相比探针成本较低。通过溶解曲线分析表明，建立的检测方法在扩增过程中没有发现有二聚体的产生。本检测体系在用空白对照及类似的乙脑病毒作为扩增对照时，没有发现非特异性产物的生成，表明该体系对于西尼罗病毒的检测是特异的。将阳性对照标准品进行10倍梯度稀释后可检测到102copies/μL样品，表明该检测体系具有较高的检测灵敏度。     

实时荧光PCR检测转基因大豆外源基因的拷贝数

快捷、准确地检测转基因植物中外源基因的拷贝数,是转基因生物育种的重要研究内容,具有较大的应用前景。本研究以7个抗虫BT(Bacillus thuringiensis)和抗草甘膦EPSPS-G10转基因大豆事件为材料,以SYBR Green I为荧光染料,利用实时荧光定量PCR方法,根据PCR反应获得的Ct值与起始模板数的对数值存在线性反比关系这一原理,建立了相关性系数在0.99以上的模板定量标线。通过目的基因与内参基因——大豆肌动蛋白编码基因ACTIN的起始模板量比较,估算出各株系的目的基因拷贝数。数据显示,株系1、2、3和4的2个基因均为单拷贝,株系6的2个基因均有2个拷贝,株系5和7的2个基因的拷贝数为3。利用Southern印迹方法对材料1~4的拷贝数进行验证,结果表明,两者的检测结果基本一致,证明实时荧光PCR检测法是大豆外源基因拷贝数检测中快速有效的方法。实时荧光PCR高效快速检测基因拷贝数,对于大规模转基因株系的外源基因拷贝数检测应用具有重大意义。     

牛Toll样受体实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立检测牛Toll样受体(TLRs)mRNA表达水平的SYBR GreenI实时荧光定量PCR方法.根据GenBank中BoTLR-2、3、4、5、7、8和10的基因序列,在其保守区设计并合成各自特异性引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶基因(GAPDH)为内参,建立实时荧光定量PCR方法.结果表明,在1×102～1×109 copies/μL范围内,BoTLRs和GAPDH基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991.溶解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的灵敏度和特异性.重复性结果表明,TLRs和GAPDH基因阳性质粒,最小检出浓度达到100和10 copies/μL,组内、组间变异系数值均保持在3.5%以内.临床样品检测结果表明,TLR3和TLR8 mRNA水平在诱导培养早期较高,在4 h达到高峰,而TLR4和TLR7水平与之相反,在诱导培养后期较高,在24 h达到高峰,表明本研究所建立的检测方法成功用于临床样品的检测,为在mRNA水平对BoTLRs的定量分析提供技术平台.     

香蕉细菌性枯萎病菌16S rDNA片段的克隆及序列分析

香蕉细菌性枯萎病是香蕉上的一种毁灭性维管束病害(Salanoubat et al．，2002)。美国、墨西哥、中南美洲、以及亚洲一些国家都有此病发生，目前我国尚无分布的报道，因此它是被我国列为禁止入境的二类危险性有害生物。我国入世后，香蕉的进口量呈明显上升趋势，而这种病原细菌在与我国有贸易关系的国家(如菲律宾等国家)中发生极为普遍，一旦这种病原细菌传入我国，将会给我国的香蕉种植业造成不可估量的损失。本     

洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系的建立

唐菖蒲伯克霍尔德菌洋葱致病型(Burkholderia gladioli pv.alliicola),是重要的植物病原细菌检疫性有害生物.本研究的目的是建立特异、灵敏、快速的TaqMan探针荧光定量PCR方法用于检测洋葱腐烂病菌(B.gladioli pv.alliicola).利用洋葱腐烂病菌保守基因序列设计和筛选特异性引物和TaqMan探针,优化PCR反应体系和反应条件.荧光定量PCR菌液检测灵敏度达到1.02×102 CFU/mL,DNA检测灵敏度达到1.73×10-4 ng/μL,反应时间仅需1h左右,对14种伯克氏菌属Burkholderia)参比菌种的特异性检测结果显示,洋葱腐烂病菌具有明显的扩增曲线生长,表明建立的荧光定量PCR体系具有非常高的特异性.同时对洋葱(Allium cepa)种子进行了模拟带菌检测,结果表明,建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够检出模拟样品中的洋葱腐烂病菌,验证了检测体系的实用性.本研究建立的洋葱腐烂病菌荧光定量PCR检测体系能够有效用于洋葱腐烂病菌的鉴定,为进出口口岸和基层检验检疫部门提供了一种简便、快速、准确的洋葱腐烂病菌分子检测手段.     

三系杂交水稻真伪及纯度实时PCR技术的鉴定

如何建立一套快速、准确的杂交水稻真伪及纯度检测体系一直是困扰着口岸检疫人员的难题。实时荧光PCR技术是近年来新兴的检验技术。通过对已报道的雄性不育特异片段R2-630WA进行PCR验证,发现其可作为鉴定杂交稻不育胞质的分子标记。依据此片段设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,对17个水稻(Oryza sativa)品种进行实时荧光PCR检测并对反应体系进行优化。结果表明:此探针能特异扩增三系杂交稻F1及不育系,并可准确地鉴定单粒稻种,准确率为100%。探针在测定低浓度(10%~40%)样品时偏差在2%左右,在测定高浓度(50%~100%)样品时,偏差在5%左右,能初步用于三系杂交稻的纯度检测。反应体系的最佳复性-延伸温度为60℃;最佳Mg2 浓度为3.5mmol/L,由此建立了一套准确、快速的三系杂交稻鉴定体系。     

发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR反应条件的建立与优化

为探讨发酵床垫料中微生物16S rDNA基因扩增实验中诸多因素对实验结果的影响,采用单因素法对16S rDNA基因扩增时PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、模板DNA)5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度、循环次数。结果表明:25μL的最佳反应体系为:10×PCR buffer 2.5μL、MgCl22.0 mmol·L-1、dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.2μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 50 ng;最佳反应程序为:在94℃下进行4 min预变性;随后循环扩增25个循环(包括94℃变性45 s,53.7℃退火30 s,72℃延伸90 s);最后在72℃下延伸10 min。     

新技术提高病原体PCR检测的灵敏度

目前,由美国农业部（USDA）的科学家们设计出一项新程序能够改进基于PCR的植物病害检测方法。曾在美国农业部农业研究服务中心（ARS）任职的植物病理学家NormSchaad认为,基于PCR的技术对引起产量下降等植物病害的检测是非常重要的工具。     

免疫捕捉PCR法检测西瓜细菌性果斑病研究

利用免疫吸附富集结合经典PCR技术建立了免疫捕捉PCR检测西瓜果斑病菌的检测法，并与直接PCR和生长检测法作了比较。结果表明，所测果斑病菌Acidovorax avenae subsp. citrulli都产生360bp左右的特异性片段，而10个不同属的对照菌株无特异性片段产生。免疫捕捉PCR检测果斑病菌的灵敏度为50-102cfu/ml，而直接PCR则在104cfu/ml，两者的灵敏度相差100倍左右。免疫捕捉PCR法对市售7种瓜种的检测发现，其中1种哈密瓜种子、2种甜瓜种子和2种西瓜种子检出果斑病菌，与人工气候箱内生长检测的发病结果基本吻合。显示了该法准确、灵敏、快速、低成本等优点。     

应用Real time PCR方法测定瘤胃液功能菌群数量

摘要：【目的】本文拟采用real time PCR技术对瘤胃液中三种功能菌即脂解厌氧弧杆菌（Anaerovibrio lipolytica,AL）,琥珀酸酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene,FS)和黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens,RF)的16S rDNA基因拷贝数进行测定,并建立起反映瘤胃液中三种功能菌的数量的方法。【方法】在相同日粮的情况下,不同个体牛在同一时间点、以及相同个体牛在不同时间点时采集瘤胃液微生物样品,并总DNA。根据三种菌16SrDNA保守序列设计特异性引物,利用Real time PCR技术考察三种功能菌的数量差异和变化。【结果】通过数据统计分析发现,不同个体动物间的三种功能菌的数量在相同时间点的差异不显著;而在不同时间点相同个体动物瘤胃中三种功能菌数量差异显著（P＜0.05）。