肌肉生成抑制素和抑制素融合表达质粒的构建和表达

以乙肝表面抗原S基因为载体,分别将肌肉生成抑制素N端基因片段和抑制素N端基因片段分别插入S基因C端和第112～113 氨基酸残基密码子之间,构建MSTN-INH融合表达质粒pVAX-SMI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pVAX-SMI构建成功。脂质体法将pVAX-SMI转染HeLa细胞,Western Blot检测表达产物的免疫原性。结果表明,融合目的蛋白成功在HeLa细胞中表达,并具有免疫原性。     

乙肝表面抗原和生长抑素融合基因在杆状病毒中表达

将乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）与生长抑素的融合基因（ＨＢｓＡｇ／ＳＳ）插入杆状病毒转移载体质粒ｐＶＬ１３９３，构成重组转移质粒ｐＶＬ１３９１ＨＳ。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂质证实ＨＢｓＡｇ／ＳＳ已插入ＰＶＬ１３９３。借助磷酸钙沉淀法，将ＣｓＣｌ超速离心纯化的重组转移质粒和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）共转染Ｓｆ９细胞，用荧光空班和酶联免疫测定法（ＥＬＩＳＡ），筛选到重组病毒ＡｃＮＰＶＨＳ。提取感     

猪肌肉生长抑制素(MSTN)前肽定点突变载体的构建及其原核表达

肌肉生长抑制素(MSTN)能够限制肌纤维的增粗增大,而突变的肌肉生长抑制素前肽(Pro-MSTN-D75A)能阻止MSTN与相应受体的结合,从而解除MSTN对肌纤维的抑制作用。猪是我国最重要的肉用家畜,通过操作MSTN提高其瘦肉产量,将对我国生猪生产具有特殊意义。本研究用通城猪妊娠3个月的胚胎为材料,提取背最长肌RNA并以此为模板,用反转录PCR扩增猪MSTN前肽cDNA序列(不含信号肽),并将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1上。通过定点突变将编码天冬氨酸的密码子变为丙氨酸密码子(D75A),构建了原核表达载体pGEX-ProM(SP-)和pGEX-ProM(SP-)D75A。重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞并经IPTG诱导表达,结果表明,转化pGEX-ProM(SP-)质粒的E.coliBL21工程菌用终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导5h表达情况最好;而转化pGEX-ProM(SP-)D75A的工程菌在1mmol/L的IPTG诱导6h的条件下表达情况最好。用GST-Trap蛋白纯化系统纯化回收总分子量大小约为51kD融合蛋白(GST蛋白标签分子量为26kD,MSTN前肽蛋白分子量为25kD)。纯化蛋白的浓度ProM(-SP)为1.87mg/mL,ProM(-SP)D75A为1.21mg/mL。本研究建立了大肠杆菌表达猪MSTN前肽的最佳条件,提高了生产效率,并为研究MSTN前肽在动物体内的生物学功能以及制备单克隆抗体提供基础资料。     

串联抑制素基因克隆与重组质粒的构建

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把p1INH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，也不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。     

反义RNA干扰MSTN对牛肌肉卫星细胞脂肪生成相关基因的影响

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成员,在骨骼肌中高表达;敲除MSTN后,肌肉质量增加、脂肪含量变少,但抑制MSTN表达后,如何影响脂肪沉积,尚未研究清楚.为了探究抑制MSTN表达后对脂肪相关基因表达的影响,本研究利用反义RNA技术,成功构建了双向表达载体pMSTN-CMV-CAG-antiMSTN,并通过Western blot筛选出抑制效果最佳的MSTN的反义载体.利用最佳反义MSTN载体在牛(Bos taurus)肌肉卫星细胞中有效干扰MSTN表达后,检测了脂肪合成相关基因(脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN),乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1))、脂肪酸氧化分解相关基因(肉毒碱棕榈酰转移酶ⅠB(carnitine palmitoyltransferase 1b,CPT-ⅠB),乙酰辅酶A氧化酶(acyl-CoAoxidase,ACOX1)和烯酰辅酶A水合酶(enoyl-CoA hydratase 1,ECHDC1))以及脂肪转运蛋白(fatty acidtransport proteins,FATP)表达的变化.结果显示,在MSTN基因被干扰后,肌肉卫星细胞中脂肪酸合成相关基因表达量上调,脂肪氧化分解相关基因中ACOX1和CPT-1B表达量上调,而ECHDC1基因表达量下调,另外,FATP表达基本没有变化.MSTN功能缺失后,脂肪合成和脂肪氧化分解过程都得到了加强,所以MSTN敲除所导致的脂肪减少并不是由于抑制了脂肪合成,而是由于脂肪分解加强,为肌肉提供更多的能量.MSTN下调后,CPT-1B的表达上调最为显著,而CPT-1B是脂肪酸β氧化的关键基因,所以研究结果提示MSTN对于脂肪的影响主要是通过影响β氧化过程实现的.研究结果为MSTN下调所导致的脂肪含量下降提供了理论依据,为MSTN作用于脂肪沉积的机制做出了初步探讨.     

转染方法对肌肉生长抑制素基因敲除载体转染效率的影响

本研究主要探讨转染方法对不同细胞系的转染效果。实验采用电穿孔和脂质体转染方法，将线性化的绵羊肌肉生长抑制素基因（myostatin）药物正负筛选（PNS）打靶载体pLoxp-1．4K-4．3KDNA导人体外培养的绵羊胎儿和成年绵羊耳部成纤维细胞中，而后采用G418和GANC进行药物抗性细胞克隆筛选和培养。结果发现，脂质体法对myostatin基因敲除载体的转染效果明显优于电击法，但电穿孔法对细胞类型的依赖性较小；采用与载体基因型相同的细胞系，两种转染方法的转染效率均略高于对照成年绵羊成纤维细胞系。     

肌肉生长抑制素基因(MSTN)外显子1的多态性及其与边鸡生长性状的关联分析

为了对边鸡生长性状的标记辅助选择提供基础资料,本研究采用PCR-SSCP技术检测边鸡(Gallusgallus)及3个对照鸡(G.gallus)群体(京海黄鸡、尤溪麻鸡和Arbor Acre鸡)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因外显子1的单核苷酸多态性,并与边鸡的生长性状进行相关性分析。结果表明,在边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡中都检测到6种基因型(AA、AB、BB、BC、AC和CC),而在Arbor Acre鸡中只检测到4种基因型(AB、BC、AC和CC)。总共检测到3个多态位点(G2100A、G2109A和C2244G)。在6～8和12周龄时,BB基因型个体的体重显著高于AA基因型个体(P<0.05)。在14周龄时,BB基因型个体的体重显著高于AA和AC基因型个体(P<0.05)。在16～18周龄时,BB基因型个体的体重显著高于其余5种基因型个体(P<0.05)。研究结果提示,MSTN基因可能是影响边鸡生长性状的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。     

胰岛素可逆性抑制牛脂肪细胞脂联素mRNA的表达

本研究从中国荷斯坦新生公犊的脂肪组织中分离培养前脂肪细胞,体外诱导分化9 d后,细胞变圆出现大量脂滴成为脂肪细胞,伴随着前脂肪细胞标志基因前脂肪细胞因子-1(preadipocyte factor-1,Pref-1)的表达消失和脂肪细胞标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)mRNA高丰度表达.利用半定量RT-PCR技术研究胰岛素对脂联素mRNA表达水平的影响,发现1 nmol/L胰岛素对脂联素mRNA的表达水平没有影响(p＞0.05),10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L胰岛素分别能显著抑制脂联素mRNA 48.7%、61.4%和61.9%的表达(P<0.05).进一步研究发现,100 nmol/L胰岛素处理脂肪细胞24 h内呈时间依赖性抑制脂联素mRNA的表达,这种抑制效应随胰岛素的除去脂联素的转录水平24 h后恢复到对照水平,用LY294002抑制磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K/Akt)信号通路后,胰岛素对脂联素的转录没有影响.结果提示,体外胰岛素在脂肪细胞中能通过PI3K/Akt信号通路可逆性抑制脂联素mRNA的表达.     

锌指核酸酶(ZFN)介导的牛肌肉抑制素基因(MSTN)突变的研究

肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉发育的负调控基因,突变后会引起肌肉的过度发育,在肉用动物育种中有非常重要的价值。本研究利用锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)对牛(Bos taurus)MSTN基因的第二外显子特异性剪切,诱导该基因的突变,从而达到敲除该基因的目的。首先对脂质体介导的双质粒共转染牛成纤维细胞的条件进行优化,获得的共转染效率高达19.27%;之后利用两组ZFNs对牛成纤维细胞进行转染,单细胞通过口吸法移入96孔板,经扩大培养后进行PCR筛选,获得18株MSTN基因突变细胞株,其中包括一株双等位基因敲除的细胞系,两组ZFNs对牛成纤维细胞的突变效率分别为6.05%和3.84%;最后,挑选一株突变细胞系进行体细胞核移植研究,共获得24枚重构胚;将去除透明带的重构胚培养于2i培养液中,获得囊胚来源的类滋养层干细胞,通过PCR和测序检测,证明该细胞系在MSTN基因第二外显子具有与供体细胞相同的突变。结果表明,所合成的两组ZFNs可以在MSTN作用位点引起突变,具有很高的突变效率,而且能获得双等位基因突变的细胞株,获得的细胞株能够用作体细胞核移植的供体细胞。本研究为肉用牛的品质改良和育种工作提供了基础资料。     

建鲤生长抑制素基因(MSTN)的分离、表达及多态性与体型、平均日增重相关性研究

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是近年来发现的肌肉生长负调控因子,属转化生长因子p(transforming growth factor-β,TGF-β)家族.本实验使用PCR方法从建鲤(Cyprinus carpio var.jian)基因组分离到4个jlMSTNs基因,4个基因具有相同的基因结构,同源性分析表明,两两分属于鱼类MSTN1和MSTN2,分别命名为jlMSTN1a、jlMSTN1b、jlMSTN2a和jlMSTN2b.jlMSTN1s和jlMSTN2s的两旁基因阅读框碱基相似性很高,分别为96%和94%,但内含子存在着长度和序列差异,jlMSTN2a两内含子明显比jlMSTN2b长,分别为1 384、1 763 bp和879、835 bp.jlMSTNs在不同组织的表达量以及各基因上SNP位点数表明,jlMSTN1s所受的选择压力高于jlMSTN2s;jlMSTN2a所受的选择压力大于jlMSTN2b.本实验还筛选到与建鲤体型和平均日增重相关的SNP位点各1个,可作为辅助育种标记.     

共表达PCV2衣壳蛋白和猪GM-CSF重组质粒的构建与体外表达

将猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)orf2和猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)基因插入同一哺乳动物细胞表达载体pIRESneo中，构建出重组共表达质粒pIRES-orf2/gm-csf。以脂质体转染方法将重组质粒pIRES-orf2/gm-csf转染COS7细胞，经间接免疫荧光实验和集落刺激形成实验检测，结果表明orf2和gm-csf基因在COS7细胞中得到表达，转染细胞呈现特异性荧光，转染细胞培养上清能剌激猪骨髓细胞形成集落。重组质粒pIRES-orf2/gm-csf的成功构建为进一步研究猪圆环病毒2型的DNA疫苗奠定了基础。     

油菜黑芥子酶基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR从浙双758油菜(Brassica napus)种子的总RNA中扩增出黑芥子酶(EC3.2.1.147)MYR J基因,并克隆测序,测序结果在GenBank中的登陆号为EF583560,其翻译的氨基酸序列与黑芥子酶(GenBank中的登陆号为Q00326)仅有一个氨基酸不同,同源性达到99%.克隆载体经Sal I酶解后将MYRI基因片段插入载体pGEX-4T-1中构建成原核表达载体pGEX-4T-1-MYR1,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中.其重组菌株经IPTG诱导表达,在90 kD处有表达量很高的1条带.用0.02 mmol/L IPTG 20℃诱导2 h,得到可溶的GST-MYR1融合蛋白,用10 mg/mL芥子苷作底物,经过检测其比活力为0.003 1 U/mg.     

表达GFP和gpt基因的重组CVI988病毒的构建

以马立克氏病病毒（MDV）CVI988株基因组为模板,利用PCR技术扩增出约2.7和3.0 kb的基因片段,将上述片段同时插入pUC19中,获得约5.5 kb MDV同源重组臂;以该基因片段的US2区的BglⅡ为插入位点,分别插入基因表达盒CMV-gpt-ployA和CMV-gfp-polyA,构建转移载体pUS-gpt-GFP,将该载体瞬时转染CHO细胞,在荧光显微镜下,可以观察到绿色荧光蛋白的表达;将该转移载体转染已用MDV CVI998株感染的次代CEF细胞,利用MX-HAT培养基筛选重组病毒,并用荧光显微镜挑选表达绿色荧光蛋白的蚀斑,结果获得重组病毒rMDVgptGFP。通过PCR检测和病毒生长测定,证明重组病毒获得纯化。     

柞蚕抗菌肽D基因重组杆状病毒表达载体的构建及其表达(简报)

昆虫抗菌肽是一类碱性小分子多肽,具有热稳定性、诱导源的非专一性和广谱的杀菌作用.抗菌肽在杀菌、抗肿瘤甚至抑制病毒复制方面具有较大的应用潜力,近年来国内外在抗菌肽的基因工程方面开展了不少研究工作.本研究采用杆状病毒载体在昆虫细胞和虫体中表达柞蚕抗菌肽D,为抗菌肽在农业、医疗卫生等方面的应用奠定基础.     

刚地弓形虫亲环蛋白基因TgCyP真核表达质粒的构建及其在Hela细胞内的表达

亲环蛋白（cyclophilin,CyP）是一类广泛存在于原核和真核生物体内的胞溶性蛋白,是刚地弓形虫（Toxoplasmngondii）速殖子的主要成分,能够诱导产生IL-12和IFN-γ,在控制弓形虫急性感染过程中起重要作用。本研究根据GenBank发表的TgCyP基因序列,设计并合成一对包含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以cDNA为模板,应用PCR技术扩增TgCyP基因。PCR产物连接到pMD18-T克隆载体。用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切克隆载体,将TgCyP目的基因克隆到载体pVAXI,构建真核表达质粒pVAXl-TgCyP。将真核表达质粒转染Hela细胞,利用问接免疫荧光检测其在Hela细胞内的表达情况。结果表明扩增的TgCyP基因与GenBank上相应基因序列（U04633．1）的一致性达100％,构建的真核表达质粒pVAX1-TgCyP能在转染的Hela细胞中表达,其表达产物与刚地弓形虫阳性血清具有免疫反应性。本研究表明Tg-CyP有望作为弓形虫疫苗的候选抗原,将为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定基础。     

含两种抗真菌基因植物表达载体的构建

近年来,植物抗真菌病害基因工程研究日益受到重视．并取得了显著进展,目前主要是通过转几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因来提高这两种酶在植物体内的表达水平,以此增强抗真菌病害的能力。体外抑菌实验表明：β-1,3-葡聚糖酶能够抑制某些真菌的生长,而一旦与几丁质酶共同作用时,其抑菌作用会大大增强。本实验将几丁质酶和葡聚糖酶     

肌抑素Myostatin突变体Pro区域的克隆、表达和活性

为了检测肌抑素Myostatin突变体的Pro区域生化活性，设计引物从肌抑素突变的双肌牛皮尔蒙特(Piedmontese)的基因组中扩增得到肌抑素突变体的Pro区域，并分别将其亚克隆到pMD18-T载体上。利用基因重组技术，构建原核表达质粒。pET30a( )／Myostatin-Pro(简称pEMPro)，在大肠杆菌(Eschetichia coli)中分泌表达肌抑素突变体Pro区域，采用亲和层析法纯化表达产物，并将其共孵育于体外培养的绵羊的骨骼肌细胞。证实肌抑素的突变体Pro区蛋白具有促进肌肉细胞增殖的功能。