中华绒螯蟹线粒体DNA 12S rRNA基因片段的序列研究

首次进行了中华绒螯蟹（Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）线粒体ＤＮＡ１２ＳｒＲＮＡ的序列分析。参考果蝇、蚤状序列对中华绒螯蟹线粒体ＤＮＡ１２ＳｒＲＮＡ基因片段做了引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定,结果得到４５７ｂｐ的碱基序列,其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分别为１５９ｂｐ（３４．７９％）、１７７ｂｐ（３８．７３％）、５１ｂｐ（１１．１６％）、７０ｂｐ（１５．３２％）、与果蝇、蚤状的相同基因片段的序列含量基     

中华绒螯蟹线粒体DNA l2S rRNA基因片段的序列研究

首次进行了中华绒螯蟹（ Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）线粒体 ＤＮＡ １２ＳｒＲＮＡ的序列分析。参考果蝇、蚤状溞序列对中华绒螯蟹线粒体ＤＮＡ １２ＳｒＲＮＡ基因片段做了引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定,结果得到 ４５７ ｂｐ的碱基序列,其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分别为 １５９ｂｐ（３４．７９％）、１７７ｂｐ（３８．７３％）、５１ｂｐ（１１．１６％）、７０ｂｐ（ １５． ３２％）,与果蝇、蚤状溞的相同基因片段的序列含量基本相似。     

中华绒螯蟹精子线粒体的检测

以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)肌肉、鳃和精巢为对照,从线粒体标志酶SDH活性、线粒体特异性荧光探针(Rh123)以及线粒体16S rDNA PCR扩增3个途径,探讨了该蟹精子线粒体的存在状况。研究发现,肌肉和鳃SDH酶活性较高,精巢SDH酶活性显著低于肌肉和鳃,而精子SDH酶活性则无法检测到。使用Rh123检测发现,精巢中有较强的荧光,而精子中则无法观察到。通过GenBank中的中华绒螯蟹线粒体16S rDNA序列设计引物,利用PCR扩增方法,以beta-actin做内参,检测了中华绒螯蟹肌肉、鳃、精巢和精子中线粒体16S rDNA扩增情况,发现各组织或细胞beta-actin扩增片段大小、条带宽度和亮度基本一致,表明各模板DNA量基本一致;而在同一DNA浓度下,16S rDNA的扩增片段长度虽一致,但其产物量存在明显差异,精子16S rDNA产物量显著低于其他3种组织,其条带宽度和亮度很弱;16S rD-NA扩增产物经测序分析及比对证明与已有序列完全吻合。上述结果表明,中华绒螯蟹精子中存在线粒体,但其线粒体的数量极显著低于精巢和其他组织,这也是利用灵敏度较低的SDH酶活性和Rh123探针以及常规的组织学和超微结构观察法难以检测到其精子线粒体的原因。[中国水产科学,2007,14(1):139-143]     

超低温冷冻对中华绒螯蟹胚胎线粒体DNA的影响

为了解超低温冷冻对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)胚胎线粒体DNA影响,选取细胞分裂期胚胎为研究对象,研究了4种玻璃化液处理和超低温冷冻对胚胎线粒体DNA的影响。结果表明:经过玻璃化液处理和冷冻后,胚胎线粒体上的Cytb基因能被稳定扩增,PCR电泳产物大小约1 600 bp,产物经回收后进行双向测序、比对和校正,获得10条Cytb基因全序列,长度为1 135 bp,其中有5个核苷酸变异位点,1 135 bp的Cytb基因序列一共编码378个氨基酸残基,从ATG第一位起始密码子开始到1 140位终止。经过玻璃化液处理和冷冻后,胚胎线粒体上的COI基因也能被稳定扩增,PCR电泳产物大小约1 600 bp,产物经回收后进行双向测序、比对和校正,获得10条COI基因全序列,长度为1 534 bp,其中有6个核苷酸变异位点,1 534 bp的COI基因序列一共编码511个氨基酸残基,从ATG第一位密码子开始到1 533位终止。经过玻璃化液处理和冷冻后,中华绒螯蟹胚胎线粒体上Cytb和COI基因共有11个位点发生了变异,但不同的玻璃化液处理和冷冻对碱基变异没有影响,发生的碱基变异中存在4种类型,即G→A、A→G、C→T、T→C,变异间只有转换发生,没有颠换发生,这些变异均未引起相应氨基酸残基的变异。     

中国大陆沿海六水系绒螯蟹（中华绒螯蟹和日本绒螯蟹）群体亲缘关系：？…

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析比较了分布于我国大陆沿海６个主要水系的两种绒螯蟹（中华绒螯蟹、日本绒螯蟹）群体间的生化遗传差异。结果发现：（１）辽河、黄河、长江和瓯江中华绒螯蟹群体间的生化遗传差异不显著,国个群体间的遗传距离Ｄ＝０．０００６～０．００５３,属种内群体间差异。（２）珠江和南流江日本绒螯蟹群体间的生化遗传差异也不显著,两个群体间遗传距离Ｄ＝０．０００７,尚未达到亚种分化水平。（３）辽河、黄河     

中国大陆沿海六水系绒螯蟹（中华绒螯蟹和日本绒螯蟹）群体亲缘关系：R …

用４８个具有丰富多态性的１０碱基随机引物对辽河、黄河、长江、瓯江、珠江和南流江的中华绒螯蟹和日本绒螯蟹的６个群体进行ＲＡＰＤ分析。结果发现：（１）两个引物具有群体特异性带,其中Ｚ２扩增的８８０ｂｐ片段为珠江蟹和南流江蟹群体中所特有,而７００ｂｐ片段为长江蟹、辽河蟹、黄河蟹和瓯江蟹所特有,可作为区别日本绒螯蟹和中华绒螯蟹的分子遗传标记;（２）Ｏｐｐ１７扩增的９４７ｂｐ片段的出现频率,在长江、黄河和辽     

中华绒螯蟹的同属种类及其英文名称

余述绒螯蟹属中三个公认种的主要特征和地理分布,并对中华绒螯蟹目前使用的几个英文名称的合理性和取舍问题加以讨论。     

中华绒螯蟹不同组织中基因组DNA含量比较

用改进后的柱式回收法提取了中华绒螯蟹不同组织中的基因组DNA,并通过紫外吸收光谱法初步分析了附肢肌肉组织、鳃、性腺组织和肝脏组织中基因组DNA的含量,初步得出同质量不同组织中基因组DNA含量大小关系趋向于:鳃>肝脏>性腺>附肢肌肉.     

中国大陆沿海六水系绒螯蟹(中华绒螯蟹和日本绒螯蟹)群体亲缘关系:形态判别分析

测量辽河、黄河、长江、瓯江、珠江及南流江六个水系绒螯蟹群体的 32个外部形态特征 ,进行聚类分析和判别分析。聚类分析将辽河、黄河、长江和瓯江四个北方水系的蟹划为一组 ,把珠江和南流江两个南方水系的蟹划为另一组 ,两组之间形态差异极显著 (P <0 .0 1)。判别分析亦可将北方蟹和南方蟹完全分开 ,判别准确率达 10 0 %。至于样本所属水系的判别 ,对北方四水系蟹的判别平均拟合概率为 86%,其中长江最低 ,为 73%,黄河最高 ,为 97%;对南方二水系蟹的判别平均拟合概率为 95%,南流江为 96%,珠江为 94 %。又对区别水系所属贡献较大的特征参数进行单因子方差分析 ,计算差异系数 ,根据Mayr等 [1953]提出的 75%规则 ,认为北方蟹与南方蟹之间的形态差异是亚种以上水平的差异 ,而北方蟹内部与南方蟹内部各水系之间差异则属不同地理种群间的差异。     

中国大陆沿海六水系绒螯蟹(中华绒螯蟹和日本绒螯蟹)群体亲缘关系:RAPD指纹标记

用 4 8个具有丰富多态性的 10碱基随机引物对辽河、黄河、长江、瓯江、珠江和南流江的中华绒螯蟹和日本绒螯蟹的 6个群体进行RAPD分析。结果发现 :(1)两个引物具有群体特异性带 ,其中Z2扩增的 880bp片段为珠江蟹和南流江蟹群体中所特有 ,而 70 0bp片段为长江蟹、辽河蟹、黄河蟹和瓯江蟹所特有 ,可作为区别日本绒螯蟹和中华绒螯蟹的分子遗传标记 ;(2 )Opp17扩增的 94 7bp片段的出现频率 ,在长江、黄河和辽河群体显著地从南到北递减 ,长江蟹 87.50 %、黄河蟹4 1.66%、辽河蟹 10 .83%。这一遗传渐变的度量可作为区别这三个水系的中华绒螯蟹种群的判据 ;(3) 6水系群体内的平均遗传相似度依次为 :辽河蟹 0 .90 8>南流江蟹 0 .897>瓯江蟹和珠江蟹 0 .895>黄河蟹 0 .890 >长江蟹 0 .850 ;6群体间遗传距离及其UPGMA、NJ聚类分析进一步表明 ,南流江蟹、珠江蟹同长江蟹、辽河蟹及黄河蟹在基因组之间存在明显的歧化。     

中华鳖与砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因序列的比较分析和分子鉴定标记

对中华鳖和砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因进行了引物设计、PCR扩增、序列测定和PCR-RbLP分析。研究结果表明：中华鳖、砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因片段的碱基序列长度相同,均为562bp,其A、T、C、G含量相似,分别为209个(37．2％)、121个(21．5％)、145个(25．8％)、87个(15．5％)和207个(36．8％)、120个(21．4％)、145个(25．8％)、90个(16％)。两序列间共有13处碱基不同,序列差异率为2．3l％,中华鳖与砂鳖各自个体间的平均核苷酸序列差异率分别为0．53％和0．36％,种间差异显著;用内切酶MspⅠ酶切两种鳖的12S rRNA基因片段,在砂鳖中可得到大小为519bp和43bp两个片段,而中华鳖无此酶切位点,这可作为准确鉴别中华鳖和砂鳖的分子鉴定标记。从两种鳖线粒体DNA 12S rRNA基因片段碱基的显著差异和MspⅠ酶切位点的变化,可以进一步证明砂鳖是不同于中华鳖的鳖属一新种。     

大泷六线鱼6个野生群体遗传多样性的12S rRNA基因分析

本文利用PCR技术扩增了6个野生群体大泷六线鱼线粒体12S r RNA基因的部分序列。在获得的582bp碱基序列中,共检测到314个变异位点,占总位点数的53.95%。34尾个体共定义了16种单倍型,6个群体的单倍型多样性指数为0.40~1.00,核苷酸多样性指数为0.00071~0.10441。中性检验Fu's Fs值为1.19782(P0.01)。分子变异分析表明:Fst=0.88326(P0.01),群体间和群体内变异分别为88.33%和11.67%。不同个体间的遗传距离构建的NJ和MP系统树表明,东港和旅顺群体亲缘关系较近,构成一个分支,其他群体构成另一分支。     

两种大眼蟹线粒体12S rRNA基因序列的比较研究

测定了宽身大眼蟹和日本大眼蟹线粒体12S rRNA基因部分片段的序列,前者为577 bp, 后者为572 bp.二者的核苷酸序列A、T、G、C的含量相似,分别为39.0%、35.7%、16.5%、8.8%;39.3%、 36.2%、 15.8%、8.7%;不包括11处插入/缺失位点,两序列间有75个变异位点,核苷酸差异率为13.18%,其中转换42个、颠换33个, 转换与颠换比约为1.3.对国内外4种大眼蟹长度为331 bp的12S rRNA基因同源序列进行分析,A+T的平均含量为76.6%,明显高于G+C的平均含量,且存有变异位点52个,简约信息位点25个.系统发生树的拓扑结构显示,所有的大眼蟹聚为一支,支持大眼蟹类为一单系.     

3种青蟹线粒体12S rRNA基因序列分析

对采自泰国、马达加斯加和日本各地的青蟹属的3种青蟹Scylla serrata(Forskal)、S．oceanica(Dana)和S．tranquebarica(Fabricius)的线粒体12S rRNA基因片段序列进行了测定,分析研究了其种间遗传差异及系统发育关系。研究结果显示：S．serrata、S．oceanica及S．tranquebarica在12SrRNA基因片段上存在长度差异,3种青蟹的序列长度分别为422bp、426bp、425bp;种内个体间无序列差异或差异极小,种间序列差异远大于种内差异。以日本鲟和底栖短桨蟹为外群,采用距离法和最大简约法重新构建了3种青蟹的分子系统树,得到的三个明显的分枝分别对应于上述3种青蟹,S．oceanica与S．tranquebarica两种间的亲缘关系较近。研究结果支持3种青蟹为不同物种的观点,建议对其进行分别的渔业管理。     

日本绒螯蟹ND 2基因全序列测定与分析

动物线粒体DNA（mtDNA）具有比核DNA的进化速率快等特点,而被广泛地应用于生物的起源、演化和种群遗传学研究。完整的线粒体基因组包括37个基因：13个编码疏水性蛋白质亚基基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因。各基因排列紧密,不含内含子,且有些基因区域出现重叠。     

长江水系中华绒螯蟹线粒体DNA的遗传多样性研究

本文对长江水系南京和江都地区中华绒螯蟹共61个个体的线粒体COI基因进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析。应用PCR技术扩增了中华绒螯蟹线粒体COI基因,选用8种能识别4碱基的限制性内切酶对该基因片段进行RFLP分析。在两个群体中共检测出8种复合单倍型,其中复合单倍型AAAAAAAA和BBBBBAAB为两个群体所共有,它的个体数所占的百分比在两个群体(南京和江都)中分别为87.9%、12.1%和50.0%、25.0%。在南京群体中,复合单倍型间的遗传距离为0.077,而在江都群体中,复合单倍型间的遗传距离为0.004～0.077;南京和江都群体的线粒体COI基因多态度(或称核苷酸多样性指数)π值分别为0.008和0.019。结果说明长江水系中华绒螯蟹具有一定的群体内遗传多样性。     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH1)-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

蜕皮抑制激素(molt—inhibiting hormone，MIH)属甲壳动物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)家族。MIH抑制Y-器官蜕皮激素的合成。以中华绒螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)眼柄总RNA为模板，根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Eriocheir japonica sinensis molt—inhibiting hormone-1，Ers—MIH1)基因序列设计引物，用RT—PCR的方法获得了Ers—MIH1基因成熟肽的cDNA片段。序列分析表明，Ers—MIH1基因成熟肽编码区含有228bp，编码75个氨基酸残基，与已发表的序列一致。将该cDNA片段插入到中间载体pMD18-T中，酶切后再将该片段插入到pGEX-4T-1表达载体中，构建成表达质粒pGEX-4T—MIH1。在BL21细胞中经IPTG诱导表达，得到GST—MIH1的融合蛋白。SDS—PAGE分析表明，经0．1mmol／L IPTG诱导4h，发现大量GST—MIH1融合蛋白表达，在分子量(Mr)为34kD处有1条特异的蛋白质条带。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1融合蛋白的成功表达为进一步深入研究MIH在中华绒螯蟹蜕皮过程中的作用机制奠定了基础。