猪卵母细胞体外成熟研究

[目的]探讨猪卵母细胞体外成熟的最佳培养条件。[方法]以NCSU-23为基础培养基,研究不同激素组合和培养时间（36、40、44和48 h）对猪卵母细胞体外成熟的影响。[结果]猪卵母细胞体外培养44 h后,成熟率最高,为81.4%;猪卵母细胞在成熟培养液培养22h后,再在无激素培养液中继续培养22 h时,成熟率最高;添加性腺激素的组成熟率显著高于不添加组,差异显著（P〈0.05）。[结论]在体外成熟培养过程中,添加性腺激素能显著提高猪卵母细胞成熟率。     

猪卵母细胞的体外成熟

取自猪卵巢含卵丘细胞且胞质均匀的，胞质不均匀和不含卵丘细胞质均匀３类卵母细胞，台盘蓝染色的存活率分别为１００％，１０％和４０％，３差异极显。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ４种培养液养的成熟率分别为１６．２％，６１．５％，５５．２％，４１．５％，差异极显。Ｅ，ＣＦ３种培养液培养的成熟率分别为３５．５％，４７．８％，５２．６％，在Ｅ培养液中加入ＰＭＳＧ和Ｅ２能显地提高成熟率。Ｃ液与卵泡液（加入２×１０＾－＾６     

山羊卵泡卵母细胞体外成熟体外受精研究

对山羊孵巢卵泡卵母细胞的采集方法、 PMSG处理山羊促进多卵泡发育及受精体系进行了研究。结果表明：切割法获可用卵数高于抽吸法， PMSG处理获卵总数及可用卵数高于对照组， BO液法的受精率高于 TALP液法，而 TALP液法的桑椹胚率高于 BO液法。     

牛卵母细胞体外成熟及体外受精的研究

本研究分析了卵巢不同性周期阶段（卵泡期、黄体期）、外源激素（ＦＳＨ、ＬＨ、雌激素）和不同卵泡液浓度（１０％,２０％,３０％）对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,卵巢的不同性周期阶段对卵母细胞体外成熟的影响不大（６３９％和５８７％）;成熟培养基中添加ＦＳＨ（１０ｍｇ／Ｌ）,ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）和同时添加ＬＨ、雌二醇（１ｍｇ／Ｌ）,可以促进卵母细胞的体外成熟,成熟率分别为６３０％,６４０％,６９１％;卵泡液（１０％,２０％,３０％）代替血清,其成熟率分别为５０７％,５７６％,５１９％,２０％ｂＦＦ效果最好。本研究对精子的两种处理方法进行了比较,发现在相同精子密度条件下（１×１０６～２×１０６个／ｍＬ）,Ｐｅｒｃｏｌ液处理精子的受精率（４７１％）显著低于上浮法处理精子的受精率（５７１％）（Ｐ＜００５）。     

猪卵子的体外成熟与体外受精研究

从屠宰猪卵巢中取出卵子，在体外培养30小时后卵丘扩散率为70．48％，第一极体释放率15．39％。卵丘层扩散的卵子体外获能的猪精液授精，受精率平均9．56％。将受精卵培养24小时，有51．22％卵子发育到2－细胞期，7．32％发育至4－细胞期。从经超数排卵的猪卵巢中取下3枚A级卵，用体外获能猪精液授精，培养24小时，其中2枚达到2－细胞期，再继续培养48小时，均达到16－细胞期。     

猪体外成熟,受精卵的体外培养研究

用自己改良的发育培养基使３．９％￣２０．１％体外成熟体外受精卵在体外发育过了４－细胞阻滞期，到达８￣１６－细胞期，个别发育到桑椹期；培养中还观察到葡萄糖对猪胚胎的体外发育没有抑制作用，说明葡萄糖不是猪胚胎体外培养中出现阻滞的原因，在培养基中添加ｐＦＦ可促进猪胚胎体外发育，使发育至８￣１６－细胞期的胚胎率从３．９％，提高到１０２．２％。     

影响猪卵母细胞体外成熟的若干因素

介绍了以屠宰场废弃的猪卵巢为材料,通过系统技术途径得到猪早期胚胎的基本方法。重点探讨了不同发育阶段、不同培养系统、不同添加成分培养液以及不同培养时间等因素对猪卵母细胞体外成熟的影响,并对其体外受精卵裂能力进行了比较与评价。结果表明,采用mTCM199作为体外成熟基础培养液,并添加直径5~8 mm卵泡的卵泡液(pFF)和雌二醇(E2),直径为2~8 mm的卵巢卵泡COCs经体外成熟培养40 h,可得到较高的成熟率(66.7%)和体外受精卵裂率(29.2%)。本研究初步建立了猪2-细胞~4-细胞早期胚胎的体外批量生产技术,可望进一步改进和完善后应用于养猪业科研与生产实践。     

猪卵母细胞体外成熟与冷冻保存的初步研究

比较从不同卵巢卵泡直径获得的卵母细胞体外成熟能力的差异 ,并研究其冷冻保存效果。结果表明 :在体外成熟培养液中添加 10 % (体积分数 ,下同 )ECS的成熟率 (72 86 % )显著高于添加 10 %NCS (6 2 2 1% ) (P <0 0 5 ) ,而添加10 %pFF则抑制卵母细胞的体外成熟。随着卵泡直径的增大 ,卵母细胞体外成熟能力逐渐增强。采用程序冷冻保存方法 ,培养成熟组的卵母细胞成活率 (35 5 9% )显著高于培养前 (2 4 6 4 % )和培养 2 4h组 (2 3 36 % ) (P <0 0 5 )。培养 2 4h(77 2 2 % )和培养成熟 (72 81% )组 ,卵母细胞解冻后的形态完整率均显著高于培养前 (5 3 2 4 % ) (P <0 0 5 )。     

猪卵母细胞的体外成熟

取自猪卵巢含卵丘细胞且胞质均匀的、胞质不均匀和不含卵丘细胞胞质均匀３类卵母细胞，台盘蓝染色的存活率分别为１００％，１０％和４０％，３者差异极显著。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ４种培养液培养的成熟率分别为１６．２％，６１．５％，５５．２％，４１．５％，差异极显著。Ｅ，Ｃ，Ｆ３种培养液培养的成熟率分别为３５．５％，４７．８％，５２．６％，在Ｅ培养液中加入ＰＭＳＧ和Ｅ＿２能显著地提高成熟率。Ｃ液与卵泡液［加入２×１０￣（－６）ｍｏｌ／（Ｌ·ｓ）ＦＳＨ］培养的成熟率分别为５０％，４４．４％，受精后的卵裂率分别为１６％，１０％，成熟率、卵裂率间均无显著差异。卵母细胞体外成熟培养３６，４０，４４ｈ后授精，其相应的受精率分别为２６．７％，４４．４％，４５．８％；卵裂率分别为０．３０％，２０％；以培养４０，４４ｈ的效果稍好，但三者差异不显著。     

不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响

探讨不同洗卵液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期发育的影响,以便开发出简易、经济的洗卵液。结果表明,使用TL-Hepes液、DPBS液、TCM-199()液和TCM-199()液作为洗卵液,对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后的早期发育没有显著影响,说明4种洗卵液均可用于猪卵母细胞的洗涤,但DPBS液配制较简易且价格便宜,是最佳的选择。     

猪体外受精技术中生殖细胞体内外成熟及获能的比较

猪体内、外成熟卵子与体外获能精子进行受精，其卵裂率分别为４３．６％和１９．６％，两者差异极显著。体内获能精子与体外成熟卵子进行受精，其受精率和卵裂率分别为５５．０％和２２．５％，增高于体外获能精子组的水平，但差异都不显著，体内获能精子不能经受常规的精子冷冻程序。     

家兔卵巢卵母细胞体外成熟和体外受精的初步试验

从家兔卵巢卵泡中抽取卵母细胞,用含有FCS、BSA-V、HCG的TCM-199液和KRB修正液于37～39℃、5％CO_2、5％O_2和90％N_2的湿润环境中成熟培养和体外受精。试验以TCM-199液为基液,第一组加入PMsG10Iu/ml,第二组加入HcG10Iu/ml,第三组加入PMSG5Iu/ml、HCG5Iu/ml,第四组加入PMSG10Iu/ml、HCG5Iu/ml。结果表明:培养40小时后,4组卵丘细胞扩展率分别为80.65％、86.00％、85.40％和85.71％,组间差异不显著(P<0.05)。第一极体放出率分别为16.47％、7.14％、12.89％和19.23％。第二组低于其他各组,但差异不显著(P>0.05)。用体外获能的精子授精,卵裂率分别为26.96％、17.39％、32.35％和39.17％。授精后29～30小时出现2-细胞;44～45小时出现4-细胞;56小时出现8-细胞胚胎。     

成熟培养基中添加成分对哺乳动物体外受精的影响

概述了在成熟培养基中添加成分，包括ＬＨ，ＦＳＨ，ｈＣＧ，Ｅ２促乳素，表皮生长因子，颗粒细胞以及血清等对卵母细胞体外成熟及随后的体外受精与体外发育能力的影响，并对其作用机理进行了初步探讨。     

中国黄牛卵巢卵母细胞体外成熟与体外受精的研究

自屠宰场和临时屠宰的黄牛体内取卵巢2批共25次,黄牛97头,共得可用卵巢卵母细胞657个。用TCM—199加雌激素(FSH、LH、雌二醇—17β)培养于5％CO_2与95％空气的39℃的CO_2培养箱中,使第1批成熟率达到55.04％,第2批成熟率达到61.7％。第1批受精率达到61.97％,移于兔输卵管中发育到卵裂,移于羊输卵管中发育到晚期桑桩胚和早期囊胚。第2批废卵率为38.3％;第10次的体外培养发育率为23.8％;羊输卵管培养发育率达到91％。利用肝素(0.005mg/ml)使精子获能,授精时的精子浓度为25×10~6/ml。用小滴培养法(小滴量为50μl)加盖无菌石蜡培养。结果证明中国老龄黄牛的卵巢还是有利用价值的。     

家畜体外受精的研究进展

家畜体外受精技术已日趋成熟。卵泡卵母细胞体外成熟率在牛、猪、绵羊和山羊分别达到90%、87%、83%和79%。精子体外获能方面,趋向于应用肝素代替钙离子载体诱导家畜的射出精子和冷冻精子体外获能,已在牛、猪、绵羊和山羊有试管后代产生。精子注入法是80年代后期发展起来的一种新型的体外受精方法,目前已取得将兔和牛精子注入的成功,并获得了发育正常的后代。     

猪卵泡卵母细胞体外受精研究

采用３种获能方法（常规获能法、肝索获能法、钙离子载体获能法）进行猪冷冻附睾精子的体外获能研究，其相应的受精率分别为４２．５％，３２．０％，３０．８％，卵裂率分别为１８．６％，１５．７％，１６．１％。受精率、卵裂率间均无显著差异。精子与ＳＭＴ－ＰＧＨ基因质粒混合培养后引起卵裂率下降，实验组的卵裂率（７．５％）显著地低于对照组的水平（２１．０％）．３９℃与３７℃下受精，其受精率分别为３８．８％。１８．７％；多精受精率分别为８９％，３０．７％；卵裂率分别为２６．９％，３．７％，３９℃组的受用率、卵裂率均显著高于３７℃组水平，而多精受精率则极显著地低于３７℃组。发育培养液Ａ液、Ｂ液中的卵裂率分别为２４．３％，１３．０％，两者无差异。在兔输卵管内培养猪体外受精卵，卵裂率为４６．７％，极显著地高于对照组水平（１０．９％）．受精卵体外培养１６～１７ｈ后离心，可观察到１８．４％的原核形成率，这与受精卵体外培养的卵裂率（１９．５％）相当。     

猪卵巢卵母细胞体外成熟与体外受精的研究

 自屠宰场取猪卵巢825个，得卵母细胞8346个，将其分为3类。分类后卵母细胞在含有pFF或PMSG的TCM-199培养液中于5%CO#-2、95%空气、饱和湿度、39℃下培养36小时。成熟卵母细胞用前培养法加肝素或咖啡因获能的鲜精，以2×10#+5/ml的精子密度体外受精。在授精12-17小时以后，一些受精卵以手术法移至受体母猪输卵管中，另一些则更换BMOC-2培养液继续体外培养。3类卵母细胞间的成熟率与卵裂率有明显的差异。成熟培养液中加入PMSG和pFF，可明显提高卵母细胞成熟率（67.7%:17.8%）和桑椹胚率（6.5%∶2.8%）用笔者的培养液，有些胚胎成功地越过4细胞阻断而获得了猪的纯体外培养桑椹胚（1990.5）。移入受精卵的9头母猪，有3头妊娠，其中1头于1990年9月产5头仔猪。离子测定结果显示不同离子（Na、Ca、Cl、K）在精子某些部分、卵母细胞和受精卵的表面分布有明显改变。RMP检测指出培养前A类和部分B类卵母细胞为负值，C类和剩余部分B类为正值。培养后不同时间3类卵母细胞RMP差异明显，说明其代谢水平强弱不一。受精后皆为负值，说明物质代谢比受精前更为活跃。     

体外培养前黄牛卵母细胞的分类、形态结构及成熟能力的研究

 自1-5mm卵泡中抽取的卵母细胞在实体显微镜下，按形态可分为四类：⑴外观正常的；⑵少丘带斑的；⑶扩展后退化的；⑷少丘均质的。通过中性红/台盼蓝染色，二乙酰荧光素染色，电镜观察和体外成熟实验等方法系统地研究了这四类卵母细胞的形态和发育能力，为牛卵母细胞体外成熟和体外受精提供了基础数据。研究结果说明，第一类卵母细胞处于最佳生理状态，体外成熟率最高；其它三类卵母细胞生理状态欠佳，成熟率很低。     

猪卵母细胞体外发育不同时期膜电位的研究

采用细胞内微电极记录方法，观察了猪卵母细胞体外发育不同时期膜电位的变化．卵母细胞在体外发育０ｈ膜电位为－８．９７±０．５ｍＶ；体外成熟发育１８ｈ膜电位为－４６．４０±１．７ｍＶ；２４ｈ膜电位为＋１０．６０±１．０ｍＶ；３６ｈ膜电位为＋２６．５０±１．０ｍＶ；５０ｈ膜电位为＋２６．４０±１．１ｍＶ；体外受精发育３０ｈ膜电位为－４０．５０±０．１ｍＶ．并据他人电镜观察结果，对卵母细胞体外发育不同时期膜电位与其代谢的关系进行了初步探讨，发现两者间具有显著的相关性．