利用重组枯草芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的研究

[目的]构建一株高产L-谷氨酸脱羧酶的重组枯芽孢杆菌B.subtilis 168/p HT01-gad A-pdx H。[方法]以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为宿主细胞,将大肠杆菌脱羧酶基因(gad A)与其辅酶磷酸吡哆醛的再生基因(pdx H)在质粒p HT01上串联表达,构建一株高产L-谷氨酸脱羧酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis 168/p HT01-gad A-pdx H。[结果]带有pdx H基因的重组菌B.subtilis 168/p HT01-gad A-pdx H催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸(GABA)的效率明显高于B.subtilis 168/p HT01-gad A。催化反应24 h时,生成的GABA浓度达252 g/L,较对照菌株提高了61 g/L。进一步对重组菌B.subtilis 168/p HT01-gad A-pdx H全细胞转化谷氨酸生成GABA的条件进行了优化,其最优条件:转化缓冲液为p H 5.0的0.1 mol/L Tris-HCl,转化温度40℃,激活剂为5 mmol/L Ca~(2+)与5 mmol/L Mg~(2+)。在上述最优条件下,催化24 h生成的GABA浓度达327 g/L。[结论]所获得的重组菌转化效率较高,具有一定的工业化应用前景。     

枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2电击转化体系的建立

[目的]建立枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株ZT4-2的高效电击转化体系.[方法]带有荧光蛋白标记的穿梭质粒pGFP78,通过电击转化法将其转入枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2.[结果]菌株培养阶段、感受态细胞浓度、感受态细胞量、质粒体积量、转化电压等条件的不同,会对电击转化效率造成影响.其中试验条件:制备感受态细胞的菌株培养阶段的OD600nm值=1.0,重悬菌体时每100 mL起始菌液加入600 μL的40％PEG6000;电击转化体系中,感受态细胞量200 μL,质粒体积10 μL,转化电压2.5 kV.最高转化效率可达6 823.67 CFU/μg.[结论]建立了枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2的电击转化体系,电击转化效率较高.     

绿色荧光蛋白基因对枯草芽胞杆菌的标记

以质粒pAD123为模板扩增出绿色荧光蛋白基因（gfp）序列，扩增产物连接到经酶切的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）整合载体pAXc，构建重组质粒pAXc-gfp. pAXc-gfp线性化后转入野生型枯草芽胞杆菌B411，gfp编码序列通过同源泉重组整合列到B.subtilis B411染色体上，获得在无抗性选择压力下稳定表达绿色荧光蛋白的重组子B412.     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

枯草芽孢杆菌3610 ClpQY基因缺失突变株的构建及其功能

为了验证枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中Clp QY基因的功能,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR扩增出Clp QY基因上下游同源序列840 bp和983 bp的片段,并与自杀质粒p MAD载体连接,构建重组质粒p MADup-down,运用化学转化法通过枯草芽孢杆菌菌株PY79,采用LOOP IN和LOOP OUT的方法,获得不带抗性,且Clp QY完全敲除的枯草芽孢杆菌3610菌株。产孢试验表明,该基因在芽孢生成中为非必需基因,而在生物膜的形成过程中具有调节作用。高温生长试验显示,该基因对细胞逆境条件下的生长存在一定的调控功能。     

Bacillus subtilis 168菌株产surfactin改造

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株基因组中含有编码surfactin合成酶系的srfA操纵子,却不产抗菌肽surfactin。运用同源重组的方法将外源的有活性的sfp基因(编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶)整合入B.subtilis 168中,将其改造为产surfactin的菌株。通过分析多株枯草芽孢杆菌和解淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的sfp基因,从基因的上、下游找出较为保守的区域,设计引物,从枯草芽孢杆菌Nja-9中扩增sfp基因,将获得的sfp基因与P43启动子和终止子相连,构建了sfp基因表达框,并连接于枯草整合质粒pDG1730上,最终构建了枯草芽孢杆菌整合质粒pST-1730,利用pST-1730本身的淀粉酶E基因与B.subtilis 168菌株的基因组DNA进行同源重组整合,获得了产surfactin的重组菌株B.subtilis121。本研究为surfactin合成酶基因的改造和分析奠定了基础。     

茂源链霉菌MTG基因pMA5载体的构建及鉴定

[目的]提高MTG产量并实现简便有效的纯化过程,以枯草芽孢杆菌为宿主构建pMA5_(mtg)重组质粒。[方法]通过提取茂源链霉菌的基因组DNA,扩增mtg基因片段,再将异源信号肽与mtg基因片段进行融合,融合片段和pMA5质粒双酶切后连接,转化到大肠杆菌感受态细胞中,菌落PCR和测序获得阳性单克隆。然后将pMA5_(mtg)重组质粒转入枯草芽孢杆菌感受态中,通过抗性筛选和双酶切鉴定获取重组菌株。[结果]成功扩增出mtg基因片段,构建出重组质粒pMA5_(mtg)。[结论]获得pMA5_(mtg)重组表达菌株,为MTG的纯化及其未来生物工程的改造提供了有效的方法。     

猪β-防御素cDNA在枯草芽孢杆菌中的高效表达

【目的】猪β-防御素(β-defensin)是猪自身分泌的一种能够杀菌、调节免疫功能的小分子抗菌肽,是猪生长繁殖不可缺少的蛋白质。【方法】根据NCBI数据库中的猪防御素cDNA序列,人工合成该基因序列,同时引入相关调控序列及适当酶切位点。酶切该人工合成的DNA后,连接到表达载体p HT43中,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得的转化子用于筛选重组表达质粒。将获得的重组表达质粒p HT43-SS-BD转化到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800N中,获得基因工程菌株。使用蔗糖诱导基因工程菌表达猪β-防御素,SDS-PAGE鉴定其分子量大小,抑菌试验测定其抑菌活性。【结果】SDS-PAGE电泳结果显示在蔗糖诱导后得到约5 KDa的目的蛋白条带;平板抑菌试验结果表明,蔗糖诱导后的上清液对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌效果,而没加蔗糖的对照组上清液无抑菌效果。【结论】该研究实现猪β-防御素cDNA在枯草芽孢杆菌中的高效表达,为解决抗菌肽来源限制及枯草芽孢杆菌的生产应用奠定了技术基础。     

表达PEDV-S1蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建及鉴定

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起新生仔猪严重腹泻和死亡,给养猪业造成巨大经济损失。根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)调节动物胃肠道菌群平衡的功能和结构特征,选择其作为PEDV S1蛋白表达的宿主菌,构建重组基因工程枯草芽孢杆菌。实验将重组质粒p LA-PEDV-S1电转至枯草芽孢杆菌,提取枯草芽孢杆菌的重组质粒,采用PCR、Western blot和免疫荧光方法鉴定阳性质粒DNA。获得了重组pLA-PEDV-S1/B.Subtilis,S1蛋白成功展示表达在菌体表面,重组PEDV S1蛋白能够和猪源PEDV阳性血清结合,具有反应原性。该重组菌可能成为预防PEDV感染的口服疫苗候选菌株。     

枯草芽孢杆菌224 yplQ基因敲除及其对溶血性的影响

为了确定枯草芽孢杆菌224(Bacillus subtilis 224,BS224)的溶血基因或引起溶血的主效基因,以枯草芽孢杆菌224基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增yplQ基因上游约1.0 kb和yplQ基因下游0.5 kb两段DNA序列,并以携带新霉素抗性基因的重组质粒pMD18-T-neo为骨架,构建基于yplQ基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yplQ,线性化后电转化至枯草芽孢杆菌224,通过新霉素抗性平板得到36个neor抗性转化子,基因组PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定yplQ18为yplQ基因缺失菌株,将其接种到5%的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测,仍能引起溶血。结果表明,单独敲除枯草芽孢杆菌224染色体上yplQ基因对菌株的溶血性无影响或影响不大。     

木薯醇腈酶在枯草芽孢杆菌中的表达及活性检测

醇腈酶(α-hydroxynitrile lyase,HNL)能够催化羰基化合物和HCN立体选择性的加工形成手性醇腈化合物。以含有木薯醇腈酶基因的重组质粒pET28a-HNL为模板,应用PCR扩增得到HNL基因,将其连接到pMD18-T载体中进行测序分析,然后通过Nde I和Xba I2个酶切位点将其连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA5Z2中,获得了含有HNL基因的重组质粒pMA5Z2-HNL,转化蛋白质三缺陷的枯草芽孢杆菌DB1342。SDS-PAGE显示HNL在枯草芽孢杆菌DB1342中获得表达,产物分泌到细胞外,每毫升发酵液中获得了2.108 U的醇腈酶。     

侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达

侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建成功的重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB6000中,转化...     

6种细菌对苹果炭疽叶枯病病菌的抑制作用

采用对峙培养法和抑菌圈法分别测定J4(枯草芽孢杆菌,Bacillus subtilis)、J6、T4、T7、P2、ZJ01(解淀粉芽孢杆菌,Bacillus amyloliquefuciens)对苹果炭疽叶枯病病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用.菌丝生长抑制试验表明,T4的抑制效果最好,抑菌率高达64.10％,与T7差异...     

食用菌制种间空气中细菌杂菌对平菇菌丝生长的影响

从唐山市周边地区平菇栽培基地的制种间空气中分离筛选到4株严重抑制平菇菌丝生长的细菌杂菌菌株,微生物学鉴定结果显示,4株细菌分别为葡萄球菌(Staphylococcus)、短状芽孢杆菌(Bacillus brevis)、假单胞菌(Pseudomonas)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。其中,葡萄球菌对平菇菌丝的抑制程度最高,其次是假单胞菌和枯草芽孢杆菌,短状芽孢杆菌的抑制程度较低。     

短小芽孢杆菌胶原蛋白酶基因COla的克隆及序列分析

根据芽孢杆菌(Bacillus)胶原蛋白酶基因序列保守区域设计一对兼并引物,采用PCR法获得胶原蛋白酶产生菌短小芽孢杆菌(B.pumilus) Col-J株胶原蛋白酶基因保守片段.序列分析表明,该片段与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)基因组序列AL009126中编码胶原蛋白酶基因序列高度同源.参考该序列,获得了短小...     

转枯草芽孢杆菌纤溶酶 (Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme,BSFE) 基因烟草营养器官显微结构特征

转枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme ,BSFE)基因及其信号肽和前肽序列烟草与野生型烟草营养器官显微结构分析结果表明：二者在细胞形态上没有明显差别。但转基因烟草的细胞层次明显少于野生型烟草；转基因烟草的输导组织木质化程度明显高于野生型烟草，且韧皮部有退化现象存在。     

枯草芽孢杆菌ComQXPA群体感应系统及其潜在生防应用

群体感应是细菌依赖细胞密度进行信息传递的一种行为模式。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中感受态调控系统ComQXPA (Com是compotence的缩写),是其重要的群体感应系统。介绍了枯草芽孢杆菌ComQXPA群体感应系统的组成,阐述了ComQXPA群体感应系统在菌体生长繁殖过程中重要调控机制的研究进展。总结了枯草芽孢杆菌作为生防菌在农业方面应用的作用机制,针对其ComQXPA群体感应系统的调控作用,提出了该系统在生防方面的潜在应用方向,以期为拓展其研究领域提供思路。     

枯草芽孢杆菌QM3原生质制备与再生研究

以青霉素、甘氨酸、溶菌酶和渗透压稳定剂等为影响因素,通过酶解,稀释平板计数等方法对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QM3原生质体的制备及再生条件进行了研究。结果表明菌株原生质体形成与再生的最适条件是:酶解缓冲液SMM pH=6.5,青霉素和甘氨酸的浓度分别为4U∕ml和4mg∕ml,时间2h;溶菌酶的浓度为2mg∕ml,在32℃下,酶解60min,形成率和再生率分别达到82.11%和89.2%。研究为枯草芽孢杆菌QM3原生质体的制备、再生条件及将其进行基因操作等相关研究奠定理论基础。     

水磨年糕中微生物的分离纯化与鉴定

通过对年糕内部和表面的微生物进行分离纯化,并通过形态观察、生化测定的方法来鉴定微生物的组成,结果表明:年糕表面的微生物主要有6种细菌、3种霉菌和2种酵母菌。细菌中4种是芽孢杆菌,分别为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和短芽孢杆菌(Bacillus brevis),2种是非芽孢杆菌,分别为乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)和乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus);霉菌分别为米根霉(Rhizopus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和米曲霉(Aspergillus oryzae);酵母菌分别为茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)和白色假丝酵母(Candida albicans)。年糕内部的微生物有巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌和白色假丝酵母,无霉菌。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。