湖北地区猪瘟病毒流行株E2基因的序列测定与分析

为分析猪瘟病毒湖北流行株(CSFV-HBWH-2017株)E2基因遗传变化规律,参照Gen Bank公布的CSFV-E2基因序列设计特异性引物,对CSFV-HBWH-2017株E2基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示,E2基因PCR扩增产物大小为1 489 bp,编码496个氨基酸,系统进化树显示HBWH-2017株与Gen Bank参考毒株的核苷酸序列同源性为86.0%~96.0%,与湖南HNLY-2011株同源性高达96%亲缘关系最近,属于同一分支2.1c亚型,表明2.1c毒株已经成为湖北地区流行毒株。     

鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析

以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。     

4株新城疫病毒株的分离与鉴定

对近三年采集的213份临床样品进行了新城疫病毒的分离与鉴定,得到4株NDV分离株,其中3株来源于鸡,1株来源于鸭。通过RT-PCR方法对毒株的F和HN基因进行了扩增与序列测定,与Gen Bank中的NDV序列进行了同源性和遗传进化分析,并测定了其致病指数。结果显示:HB0601和HB0804株为强毒株,属于基因Ⅶb亚型,其F基因与Chicken-Jiangxi-07-2009同源性最高,为99.5%和99.7%,与La Sota株的同源性为82%。SC1805和HB1906为弱毒株,属于基因Ⅰ型,其F基因与Chicken-Colombia-1326-14475-2009同源性最高,分别为99.8%和99.9%,与La Sota株的同源性为89%。4株NDV分离株与传统疫苗株的遗传进化关系较远。研究为ND的防控及分子流行病学研究提供了数据支撑。     

蜜蜂残翼病毒RT-PCR检测及衣壳蛋白VP1基因的序列分析

为了研究蜜蜂残翼病毒(DWV)的遗传变异特点,试验从吉林某地蜂场疑似蜜蜂残翼病的病蜂中初步分离得到1株DWV毒株,采用RT-PCR技术扩增VP1基因并对其进行检验分析。结果表明:基因测序结果与Gen Bank中的DWV毒株衣壳蛋白VP1基因序列同源性为99%左右;将此分离毒株DWV的VP1基因核苷酸序列与Gen Bank中的10个序列进行系统遗传进化树分析,证实其与AB070959.1、NC_005876.1的同源性最近,而与HM067437.1、KJ437447.1的同源性最低。     

牛巴贝斯虫lytB基因的克隆与序列分析

为了对牛巴贝斯虫lytB基因进行克隆与序列分析,试验以兰州株牛巴贝斯虫lyt B基因组为模板进行PCR扩增,将扩增得到的特异性产物克隆到p GEM-T Easy载体上,并对其进行PCR检测、酶切鉴定及序列测定分析。结果表明:试验克隆得到的864 bp基因片段与Gen Bank收录的牛巴贝斯虫lyt B核苷酸序列同源性为97.8%。说明试验成功克隆出牛巴贝斯虫lyt B基因,与Gen Bank收录的牛巴贝斯虫lyt B核苷酸序列具有高度的同源性。     

猪圆环病毒2型乌鲁木齐分离株全基因序列遗传变异分析

为分析乌鲁木齐市猪圆环病毒2型(PCV2)遗传变异情况,对疑似感染PCV2组织样品的全基因组进行PCR扩增、克隆和测序,并进行序列比对与遗传进化分析。结果表明,测序的5株PCV2基因组3株全长为1 766 bp,2株全长为1 767 bp,5株PCV2核苷酸序列同源性在96.1%~99.5%之间,与Gen Bank国内外已发表的17株PCV2基因核苷酸序列同源性在94.5%~99.7%之间;遗传进化树显示,3株属于新出现的PCV2d亚型毒株,2株属于国内优势流行的PCV2b亚型毒株。     

犬细小病毒YBYJ株NS1基因的克隆及序列分析

为了克隆YBYJ株犬细小病毒(CPV)NS1基因,并对其进行序列分析,试验选择Gen Bank中的CPV-NS1基因(登录号为NC_001539)序列设计1对特异性引物,以延边大学预防兽医学实验室分离的CPV YBYJ株为毒株,经PCR扩增得到NS1基因,将其克隆至p MD18-T simple载体,然后进行基因测序和序列分析。结果表明:YBYJ株CPV-NS1基因大小为2 007 bp,编码668个氨基酸,与国内外其他10株CPV-NS1基因的核苷酸同源性为98.0%~99.7%,氨基酸同源性为96.7%~99.7%。提示CPV-NS1基因变异较小,遗传进化相对稳定。     

鸭胚中鸭坦布苏病毒的分离与鉴定

从山东省某种鸭场送检的鸭胚中分离到1株鸭坦布苏病毒(TMUV),命名为SDBZ株。根据Gen Bank上已发表的TMUV NS3基因序列设计一对引物,利用RT-PCR对该分离株NS3基因扩增并测序,将获得的SDBZ株NS3基因与Gen Bank中的11株TMUV及10株其他黄病毒属病毒基因进行对比分析。结果表明,该分离株NS3与Gen Bank上已发表的TMUV-WZDu、SDLY、JS804的同源性可达98.9%,与其他黄病毒属病毒基因同源性较低,为53.7%~77.2%。该研究结果为证明TMUV垂直感染提供了流行病学依据。     

苏太猪源TTP基因的克隆及其遗传进化分析

为了分析苏太猪源Tristetraproin(TTP)基因CDS序列和遗传进化关系,试验根据Gen Bank公布的野猪源TTP基因设计1对特异性引物,通过RT-PCR从苏太猪血液中扩增出TTP基因CDS区,并进行克隆和遗传进化分析。结果:扩增所得的TTP基因CDS长度为981 bp,共编码326个氨基酸。同源性分析表明:该基因核苷酸编码序列同源性与Gen Bank中公布的野猪源TTP基因一致性最高,为99.8%。系统进化树显示:该基因与野猪源TTP基因在遗传进化树上位于同一分支,亲缘关系最近;与白鱀豚、虎鲸的亲缘关系最远。     

基于线粒体pcox1分析头槽绦虫种系发育关系

为阐明鱼头槽绦虫线粒体中的细胞色素c氧化酶第一亚基部分序列(pcox1)的遗传多态性,研究鱼头槽绦虫种系发育关系,以湖南省部分地区鱼头槽绦虫为研究对象,通过聚合酶链式反应(PCR)对其线粒体pcox1基因进行扩增并测序。序列分析比对后,结合Gen Bank收录的头槽绦虫以及其他科绦虫的序列,共同构建系统进化树,以此分析鱼头槽绦虫种内与种间的遗传关系。结果表明:湖南各分离株的pcox1长度为389～412 bp,各分离株间的同源性为93%～100%,与Gen Bank中收录的鱼头槽绦虫的同源性为99.2%～100%,序列均位于进化树同一分支上;本次收集的21株分离株与其他种绦虫序列的同源性为70.3%～80.0%,且进化树分支相距较远。结果说明鱼头槽绦虫的pcox1在不同地区种内均相对保守,种间差异较大,可以作为种间遗传变异研究的分子标记。     

接触传染性脓疱皮炎病毒B2L基因的克隆和序列分析

参照文献和 Gen Bank发表的接触传染性脓疱皮炎病毒 (CPDV ) NZ- 2株的 Bam H / B片段的基因序列 ,设计并合成 1对引物 ,通过 PCR扩增出国内 CPDV疫苗株和 3个分离株的 B2 L 基因 ,目的片段长约 1.13kb。将目的片段克隆到 p MD18- T载体后进行序列测定 ,并用 DNAStar软件比较分析国内的 CPDV株与 NZ- 2株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果表明 ,国内疫苗株和 3株分离株的核苷酸序列同源性分别为 99.7%、96 .9%和 97.4 % ,与国外 NZ- 2株的同源性为 96 .1%。国内 CPDV株与 NZ- 2株的氨基酸序列同源性分别为 92 .0 %～ 96 .0 % ,表明CPDV Bam H / B2 L基因变异的幅度小。     

黑蜂王台病毒中国BQCV-JL1株衣壳蛋白VP基因克隆及序列分析

为了研究黑蜂王台病毒在中国的发展情况,在吉林省内疑似蜜蜂黑蜂王台病病料中分离到1株BQCV毒株,记为中国BQCV-JL1(KP119603),对该分离株提取RNA,采用RT-PCR技术扩增其VP基因。结果表明:VP基因测序结果与Gen Bank中报道的BQCV VP基因序列同源性在89%~99%之间。将VP基因序列与Gen Bank中报道的17个序列进行系统遗传进化树分析,其中与日本分离株4(AB605360)、日本分离株3(AB605359)、日本分离株2(AB605358)及日本分离株Ac1(AB638414)、日本分离株Am3(AB638413)、日本分离株Am2(AB638412)株同源性最高(99%),而与南非分离株(AF183905)同源性最低(89%)。     

新疆南疆牛乳头状瘤病毒鉴定与基因分型

为探究新疆南疆某奶牛场疑似感染牛乳头状瘤病及病毒基因型,本试验采取牛皮肤病变肿瘤样组织,进行组织病理学检查,并提取病料DNA,以乳头状瘤病毒(bovine papillomavirus,BPV)L1基因简并引物和通用引物(FAP59/FAP64和MY11/MY09)进行PCR扩增、测序、序列分析及遗传进化树构建。测序结果表明:新疆南疆Aks-01株与Gen Bank收录的BPV-2基因型参考株核苷酸序列比较,核苷酸同源性可达95%,为BPV-2基因型;与BPV-1、BPV-13基因型参考株遗传进化关系最近,同属Delta属。结合临床症状、组织病理学检查,确定该奶牛场牛乳头瘤由BPV-2基因型感染引起。     

猪鼻支原体的分子鉴定及进化分析

本研究对青藏高原地区青海猪鼻支原体分离株(Mhr-QH1)进行了Mhr-p37基因的克隆鉴定及测序分析,并利用Mhr-16S rRNA基因与Gen Bank中相关菌株基因进行了基因同源性比较和遗传进化分析。Mhr-p37基因和16S基因PCR扩增测序结果显示,获得核苷酸序列长度分别为346bp和1500bp,Mhr-QH1-p37基因核苷酸序列与中国株、法国株和美国株的同源性达到100%;同样16S rRNA基因与巴西分离株的16S rRNA基因同源性也为100%,与日本、瑞典和美国分离株的同源性为99%。进化树分析发现:Mhr-QH1分离株与巴西株聚为组成一个微小分支,与美国株和巴西株共聚为同一个大支上,并与其他Mycoplasma spp.种系进化距离较远。因此,本研究对青海猪鼻支原体菌株的Mhr-p37基因序列和蛋白氨基酸序列分析,及16S rRNA基因系统进化研究的结果,有望为我国猪鼻支原体病的分子流行病学调查提供一定的数据参考,同时提示猪场搞好饲养管理是预防本病的关键。     

锦州地区一例蜜蜂残翼病的RT-PCR诊断与蜜蜂残翼病毒的鉴定及同源性分析

为确诊锦州某蜂场蜜蜂大量死亡病因,本试验采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,收集病死蜜蜂提取总RNA,进行反转录,获得c DNA。然后,以c DNA为模板,利用检测常见蜜蜂病毒的引物进行PCR扩增。结果表明,从蜜蜂病料中扩增出编码蜜蜂残翅病毒Helicase蛋白酶的基因片段,大小约702 bp,将分离毒株命名为DWV-JZ。测序结果通过BLAST比对以及与Gen Bank中获得的7个序列进行遗传进化分析,证实DWV-JZ与Gen Bank中的DWV-JL1(KP096414.1)同源性达到95%,亲缘关系最近。     

基于oppD/F基因的牛支原体贵州株分子生物学鉴定

为了确定疑似牛支原体(Mb)肺炎病例病原种类,试验采用分子克隆技术对牛支原体贵州流行株oppD/F基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明:所合成引物从支原体分离培养物中扩增出大小约为1 912 bp基因片段,与预期oppD/F基因片段的大小相符,其测序序列与Gen Bank数据库中参考株核苷酸同源性为42.6%~99.8%,与标准株核苷酸同源性为99.6%,与从发病动物中分离得到的内蒙株和湖北株同源性最高(均达到99.8%),与其他途径分离得到的参考菌株同源性都很低;系统进化树分析显示,牛支原体贵州分离株与标准参考株在同一进化分支上,与临床易混淆的丝状支原体丝状亚种存在明显差异。说明此次从疑似牛支原体肺炎病例中分离培养的支原体确为牛支原体。     

猪瘟病毒四川分离株E2基因克隆及生物信息学分析

利用Gen Bank登录的猪瘟病毒(CSFV)参考株(登录号:NC_009089.1)的E2基因序列设计特异性引物,PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取RNA,采用RT-PCR技术扩增CSFV疫苗株E2基因,将PCR扩增产物克隆入Pet-32a-BL21载体构建重组质粒门Pet-32a-E2,并进行测序鉴定。测序结果显示,构建的Pet-32a-E2质粒含有1个开放阅读框(ORF),全长1119 bp,共编码373个氨基酸,与Gen Bank登录的CSFV参考株NC_009089.1的E2蛋白的核苷酸同源性为98.8%,氨基酸同源性为98.9%;与石门株兔化弱毒E2蛋白株的核苷酸同源性为94.4%,氨基酸同源性为93.9%。对E2基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果显示,E2蛋白分子质量为41.6 ku,等电点PI为5.72,是弱酸性蛋白;E2蛋白不含信号肽序列,为可溶性蛋白,有跨膜区,主要定位于细胞质内。通过生物信息学分析预测,为后期CSFV E2蛋白表达,开展蛋白功能研究奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株(SD/97/02)基质蛋白、5a、5b 蛋白基因的克隆和序列分析

参考 Gen Bank上的传染性支气管炎病毒 (IBV)序列 ,自行设计合成了 3条引物 ,对 IBV青岛腺胃分离株 (SD/97/ 0 2 ) RNA进行 RT- PCR扩增 ,扩增含基质蛋白 (M)及 5 a、5 b蛋白基因的约 1.6 5 kb的片段 ,对 PCR产物进行克隆后测序。序列分析显示 ,M蛋白基因与其他 IBV相应的基因同源性在 90 .33%～ 92 .75 %之间 ,氨基酸序列比较 ,同源性在 89.82 %～ 94.2 5 %之间 ;5 a基因与其他 IBV的基因同源性在 84.34 %～ 87.37%之间 ,氨基酸同源性在 81%～82 %;5 b基因与其他 IBV的基因同源性在 91%～ 92 %之间 ,氨基酸同源性在 93%左右。     

羊口疮病毒贵州株F1L基因克隆及生物信息学分析

为分析羊口疮病毒贵州株(ORFV-GZ株)F1L基因的分子特点,预测编码蛋白的生物学功能,本试验对ORFV-GZ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件及方法,对ORFV-GZ株F1L基因进行列分析并对其编码蛋白进行了二级结构、B细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示,F1L基因PCR扩增产物大小为1 029bp,编码342个氨基酸;与OV-SA00株、NZ2株、OV-IA82株和D1701株相应序列核苷酸同源性分别为98.4%、97.9%、97.8%和96.8%,氨基酸的同源性分别为98.3%、97.6%、97.3%和95.3%;系统进化树显示,ORFV-GZ株F1L基因与FJ-GT株亲缘关系最近;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲所占比例较大,预测此蛋白可能存在7个B细胞优势抗原表位,两个跨膜区域,无信号肽区域。本试验结果将为贵州省ORFV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

一株鹅圆环病毒的全基因组测序及序列分析

从山东省潍坊地区某朗德鹅鹅场的发病鹅体内检测到1株鹅圆环病毒,命名为SDWF-01。根据Gen Bank上已发表的鹅圆环病毒序列,设计了一对特异性引物,利用PCR技术对该株病毒进行全基因组克隆并测序,对其基因组核苷酸组成、结构及遗传进化特性进行分析。结果表明:SDWF-01株全长1 821 bp,编码4个开放阅读框;与Gen Bank上已发表的鹅圆环病毒核苷酸序列同源性为91.4%~98.5%,其中SDWF-01株与yk3毒株的同源性最高(98.5%),而与浙江株xs5的同源性最低(91.4%)。研究首次对山东地区鹅圆环病毒进行检测,并完成全基因组克隆测序及核苷酸序列分析。