具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶功能的家蚕l(3)neo18基因的克隆与表达特征

果蝇l(3)neo18基因可以通过P转座子诱发致死突变,编码的蛋白质具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶(ND)的功能。利用生物信息学、cDNA末端快速扩增(RACE)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法,克隆了家蚕l(3)neo18同源基因,分析了基因结构与表达谱。Bm-l(3)neo18基因(EU826676)的cDNA全长为868 bp,由573 bp的完整开放读码框(ORF)序列、25 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和251 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码蛋白质为190个氨基酸残基,分子质量22.7 kD,pI 9.60。Bm-l(3)neo18基因由3个外显子和2个内含子组成,定位于家蚕第3染色体,位于nscaf2930的1 203.8-1 205.6 knt。Bm-l(3)neo18蛋白质在1-185氨基酸残基位置为ND的SGDH亚基保守区,在61-83氨基酸残基位置具有一个保守的跨膜区域。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(3)neo18与埃及伊蚊等昆虫ND具有50%以上的蛋白质同源性,ND的保守区域高度一致,NJ法分子进化分析也显示Bm-l(3)neo18与昆虫ND进化上同源。该基因除在家蚕卵期的表达量较低外,在幼虫、蛹和蛾期均有较高表达,且存在组织差异性。     

二化性家蚕滞育发动期间滞育性卵和非滞育性卵的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸变化

为了探究家蚕滞育发动期间呼吸耗氧量下降与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)含量变化的关系,用高效液相色谱法和分光光度法分别检测在25℃条件下产下后12～72 h的二化性家蚕滞育性卵与非滞育性卵中的还原型NAD(NADH)含量、氧化型NAD(NAD+)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性和胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)活性。滞育性卵中的NADH+NAD+含量、NADH/NAD+值及LDH活性分别在产下后18、36、24 h达到峰值,而cMDH活性处于波动中。在产下后24～72 h,非滞育性卵中的NADH/NAD+值极显著低于滞育性卵,而LDH和cMDH活性极显著高于滞育性卵。据此可以推测,滞育发动期间家蚕滞育性卵的NAD+降解增强和NAD+再生下降共同导致呼吸耗氧量下降。     

催青温度对家蚕二化性品种丙酮酸脱氢酶激酶基因(BmPDK)表达的影响

丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)在生物体的新陈代谢中具有重要的生理功能。为了探讨家蚕(Bombyx mori)PDK基因的表达特性,用蛾区半分法将二化性家蚕品种的活化越年卵(丙2期)分别以常温(25℃)光照和低温(15℃)黑暗催青,通过实时荧光定量PCR技术检测分析2种温度催青处理后家蚕不同发育阶段和不同组织的BmPDK表达水平。常温光照催青区BmP-DK的表达水平表现出发育时期和组织差异:胚胎发育阶段BmPDK在己4期的表达水平最高,其次是戊2、己3和己5期;幼虫发育阶段BmPDK的表达水平在蚁蚕期极显著高于其它龄期,5龄期在卵巢和精巢的表达水平高于其它组织;蛹期BmPDK的表达水平比其它发育时期低;成虫期的表达水平与胚胎发育末期相当,其中雌蛾的脂肪体和卵巢中BmPDK的表达水平较高。推测BmPDK在家蚕胚胎发育末期及产卵过程中有重要作用。催青温度影响BmPDK在家蚕各发育时期及卵巢组织中的表达水平:胚胎发育阶段戊2期BmPDK的表达水平为常温催青区显著高于低温催青区,己3～己5期常温催青区BmPDK的表达呈低-高-低的趋势,而低温催青区则呈上升趋势;蚁蚕期BmPDK表达水平为低温催青区极显著低于常温催青区;蛹期和成虫期卵巢中,常温催青区BmPDK的表达水平极显著高于低温催青区。催青温度对二化性家蚕BmPDK的表达的影响主要出现在胚胎戊2期、胚胎己3期～蚁蚕期、蛹期、成虫期。     

骨骼肌纤维烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶组化染色的检测

本文应用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶（NADH-TR）组化染色，将大鼠与家兔小腿胫前肌与腓肠肌的肌纤维型分成染色最深的快缩氧化FO型、染色较深的慢缩氧化SO型、染色浅的快缩氧化酵解FOG型及染色最浅的快缩酵解FG型纤维。这与定量分析结果相吻合。并对低温液氮保存骨骼肌标本进行观察，发现小块肌组织＋生理盐水和小块肌组织＋5％二甲基亚砜（DMSO）冷冻保护剂的玻璃化冻存一起浸入液氮制成切片，都未见冰晶形成；而在用5％二甲基亚砜玻璃化冻存大块肌组织切片见有少量冰晶出现；未使用5％二甲基亚砜玻璃化冻存大块肌组织切片见有大量冰晶出现。提示小块标本超快速浸入液氮内能减少冰晶形成，保证酶组化染色切片的质量。并进一步对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶组化作用机理与孵育液的科学配制进行了探讨。     

纳豆激酶基因在家蚕生物反应器中的表达

纳豆由枯草杆菌(Bacillussubtilis)或纳豆菌(Bacil-lusnatto)发酵大豆而成。1987年,日本学者须见洋行等首次从传统食品纳豆中发现了一种具有溶栓活性的酶制剂,并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。纳豆激酶具有易于提取.溶栓效果好.无毒副作用,体内半衰期长,成本低,可降压、杀菌和抗病毒等优点,因而可能成为新一代的抗栓药物。杆状病毒是一类闭合双链DNA病毒,昆虫杆状病毒表达系统是80年代建立起来的真核表达系统.其表达效率高.具有包括糖基化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统.其表达产物多具有可进行翻译后修饰.具有与天然产品相似的生物活性     

家蚕核苷二磷酸激酶基因的克隆和原核表达

核苷二磷酸激酶(NDPK)基因在进化中高度保守,却又呈现复杂多样的生物学功能。该酶除了催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性,并参与转录调控和信号转导。从家蚕蛹cDNA文库中获得家蚕核苷二磷酸激酶的cDNA序列,该cDNA序列长575bp,含465 bp的开放阅读框序列,编码154个氨基酸残基的核苷二磷酸激酶。将克隆的家蚕核苷二磷酸激酶基因插入pET-28 a构建重组质粒,转化大肠杆菌后诱导表达重组蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到重组家蚕核苷二磷酸激酶。     

家蚕微孢子虫丙酮酸激酶基因的克隆与表达特征分析

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)在糖酵解最后一步起着不可逆的作用,可以催化磷酸烯醇式丙酮酸将高能磷酸基团转移给ADP生成ATP和丙酮酸。通过在NCBI和家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)数据库中对丙酮酸激酶基因的比对分析,选择家蚕微孢子虫丙酮酸激酶M2亚型的一个基因(NbPK-2,GenBank登录号EOB11679.1)进行克隆。生物信息学分析显示,该基因序列长度为1 359 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码452个氨基酸,预测蛋白质等电点为7.13,相对分子质量为51.7 kD,没有信号肽;NbPK-2蛋白的二级结构预测显示其含有38%的螺旋、21%的延伸片段和40%无规则卷曲。通过qRT-PCR检测感染微孢子虫后家蚕不同发育时期的NbPK-2表达水平,发现该基因在感染后24 h内处于相对较高的表达水平,而此后表达水平开始降低,至144 h达到最低值,在168 h又有所升高。研究结果可促进对家蚕微孢子虫糖酵解途径的研究,为家蚕微粒子病的防控奠定理论基础。     

家蚕Atlastin基因(BmATL)的鉴定及表达模式

Atlastin基因是人类遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegia,HSP)疾病的致病基因之一。Atlastin蛋白具有典型的GTP结合(GBP)结构域和2个相邻的跨膜结构,被定位在高尔基体和内质网膜上,具有运输小囊泡的功能。用人类和果蝇的Atlastin基因序列对家蚕基因组数据库进行同源搜索,鉴定得到4个同源基因,命名为BmATL1-BmATL4。生物信息学分析显示这4个基因编码的蛋白质都有GBP结构域,其中:BmATL1和BmATL2的分子质量约60 kD,有2个相邻的跨膜结构;BmATL3和BmATL4的分子质量约85 kD,没有跨膜结构。表达谱分析表明BmATL1和BmATL2在家蚕5龄第3天幼虫各组织都有低量表达,BmATL3和BmATL4在血细胞中特异高量表达。综合分析提示:BmATL1与人类和果蝇Atlastin的分子质量、结构域和表达谱特征相似。     

家蚕胚胎发育相关基因的分析(英文)

在家蚕基因组中检索分析了与果蝇86个胚胎发育相关基因同源的基因。分析结果表明,在果蝇的这86个基因中,有62(72%)个基因在家蚕基因组中存在直向同源关系,其中58(67%)个基因并且在家蚕、果蝇、冈比亚按蚊3种昆虫的基因组间呈现1∶1∶1直向同源关系。通过比较分析发现,体节极性决定基因在3种昆虫基因组间最为保守。同果蝇和冈比亚按蚊相比,家蚕中决定背-腹部形成的基因分化最大。进一步利用芯片数据对其中的12个母性基因在家蚕5龄第3天幼虫生殖腺中的表达情况进行分析:有2个基因(orb和nanos)在卵巢中特异表达;4个基因(spire、Ras85D、gd和arrest)在精巢中特异表达;另外的6个基因(exuperantia、vasa、pumilio、mago nashi、nudel和dorsal)在精巢和卵巢中均有表达,但是其中的2个基因(pumilio和nudel)在雌、雄间的表达量存在显著差异。研究结果为家蚕发育调控机制的进一步研究提供了重要线索和数据信息。     

多角体蛋白基因核苷酸序列对HBsAg(PreS2+S)在家蚕中表达的作用

应用PCR突变的方法 ,在乙肝病毒表面抗原 (HBsAg)前S2序列的 5’端融合了BmNPV多角体蛋白基因5’端的 12个碱基 ,获得了融合乙肝表面抗原中蛋白基因 (HBMp) ;通过同源重组将其插入到BmNPV基因组多角体启动子后 ,构建了重组杆状病毒BmPAK HBMp。用重组病毒BmPAK HBMp和BmPAK HBM(带有非融合乙肝表面抗原中蛋白基因 )感染家蚕细胞及蛹 ,对两种病毒的表达产物用ELISA进行了跟踪检测 ,结果表明融合蛋白比非融合蛋白HBsAg活性提高了 6 0 %～ 80 % ,作为HBsAg构成部分的PreS2抗原性提高了 8～ 10倍 ;并且HBsAg和PreS2 Ag表达的时相曲线不同 ,PreS2 Ag的表达量比HBsAg早 1～ 2d达到最大值。ELISA检测和Westernblotting分析表明 ,多角体基因序列的存在更有利于中蛋白全基因 (PreS2 +S)的表达。     

家蚕亲环蛋白A基因(BmCyPA)的克隆与表达分析

亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。     

家蚕C-Jun氨基末端激酶基因不同剪接体的发现和表达研究

C-Jun氨基末端激酶(JNK)信号途径在生物体应对内部和外部压力过程中承担重要角色。作者首次在鳞翅目模式昆虫家蚕中发现BmJnk基因存在剪接体。其中1条128bp的外显子可以导致BmJNK蛋白N端的氨基酸序列的差异,产生BmJNKa和BmJNKb 2种氨基酸序列。5龄第3日幼虫多组织表达谱调查结果表明,大造品种的10种组织中都存在剪切体BmJnka和BmJnkb,但2种剪切体在不同组织中的mRNA水平存在差异。家蚕幼虫化蛹变态期间的丝腺退化过程中,BmJNKa和BmJNKb的mRNA转录水平上调,表明BmJNK参与了丝腺消亡过程的调控。37℃高温逆境环境诱导,家蚕BmN细胞中的BmJnka和BmJnkb的mRNA水平上调,表明家蚕BmJnk基因可以通过mRNA水平的表达来应对外界环境压力。     

家蚕BmE(spl)-like基因的克隆与表达谱分析

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条新的cDNA序列,生物信息学分析发现其编码的蛋白质序列与果蝇Enhancer of split基因[E(spl)]编码的DNA结合转录调控因子bHLH(helix-loop-helix)有较高的同源性,将该基因命名为BmE(spl)-like(Bombyx mori Enhancer of split like)。该基因的ORF长606 bp,编码201个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量22.3 kD,等电点9.7。构建重组表达质粒pET-28a-BmE(spl)-like并在E.coli BL21(DE3)菌株中表达BmE(spl)-like蛋白,经亲和层析和FPLC反向柱纯化融合蛋白His-BmE(spl)-like并制备了抗体效价1∶25 600以上的多克隆抗体。用qRT-PCR方法检测BmE(spl)-like在家蚕成虫发育期的转录水平最高,结合果蝇同源基因的功能,推测该基因与蚕蛾的翅发育相关;该基因在家蚕5龄幼虫各组织中的转录水平以表皮最高,马氏管中最低。Western blotting检测BmE(spl)-like在家蚕5龄幼虫性腺中的表达水平最高,其次是丝腺、表皮、脂肪体、肠组织,在头部、马氏管和气管中的表达水平极低,与qRT-PCR检测的BmE(spl)-like在各组织中的转录水平有些差异。     

家蚕体节极性基因(Bmdpp)的克隆与表达研究

体节极性基因dpp是昆虫发育过程中的关键基因。采用生物信息学的方法,利用家蚕EST数据获得了家蚕dpp基因(Bmdpp)cDNA序列。该cDNA序列全长1 206 bp,ORF1 146 bp,编码381个氨基酸,预测蛋白分子质量38.6 kD,等电点9.18。将克隆的Bmdpp基因完整CDS序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体,转化、诱导后经SDS-PAGE电泳检测到约40 kD与预测分子质量相符的目的蛋白条带。对Bmdpp在家蚕胚胎不同发育时期的表达分析发现,该基因在受精6~14 h的表达量很低,甚至没有表达。这一表达模式和果蝇dpp基因在胚胎发育过程中的表达模式相似,推测Bmdpp在家蚕早期胚胎发育的背-腹轴分化中起作用。     

家蚕微孢子虫己糖激酶基因的克隆及序列结构分析和原核表达

己糖激酶(hexokinase,HXK)是糖酵解途径的限速酶,在能量代谢中充当极其重要的角色。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)具有完整的糖酵解途径,其基因组中有2个序列相似度较高的己糖激酶编码基因拷贝(NBO_1320g0001,NBO_27g0008)。根据其中的一个基因拷贝(NBO_27g0008)序列设计特异性引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板成功克隆了该基因,命名为Nb HXK-1。该基因大小为894 bp,包含完整的ORF,编码297个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为34.241 k D,等电点(p I)为5.26,蛋白质的氨基酸序列有31个磷酸化位点和4个潜在的N-糖基化位点,无跨膜结构域,有信号肽,二级结构主要由α螺旋(54.55%)、延伸片段(17.80%)和无规则卷曲(27.61%)组成。系统进化分析显示Nb HXK-1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)己糖激酶(Nc HXK)氨基酸序列的亲缘关系较近。将Nb HXK-1基因插入原核表达载体p ET-28a(+)并转化BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达后经蛋白质串联质谱鉴定和Western blot分析显示,获得了与预期大小一致的约35 k D的重组Nb HXK-1蛋白,为进一步阐明Nb HXK-1的生物学功能奠定了基础。     

家蚕核型多角体病毒p35基因的核苷酸序列分析

对家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)p35基因的序列分析表明 :BmNPVsup35编码序列为 897nt,编码 2 98aa。同源性分析表明 :BmNPVsup35与BmNPVT3、AcNPV、SlNPV在核苷酸水平上同源性分别为 99.5%、95.1 %、89.3% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 98.7%、89.4 %、76.4 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BmNPVT3中位的N14 6、S2 0 2 、E2 0 4 、K2 4 4 ,在BmNPVsu中分别被G、N、Q、N取代 ,BmNPVT3中S2 2 2 ,在BmNPVsuP35中发生了缺失。推测BmNPVsuP35蛋白的功能及抑制细胞凋亡的能力与BmNPVT3P35蛋白的相似     

家蚕凋亡蛋白酶(caspase-1)基因在大肠杆菌中的表达

为了研究家蚕凋亡蛋白酶(caspase-1)的原核表达及剪切方式,用PCR法扩增出家蚕caspase-1基因的cD-NA,然后插入pET28a载体,得到阳性质粒pET28a-caspase-1,并转化感受态细胞BL21,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导了caspase-1蛋白的表达。应用SDS-PAGE和Western blot分析对其性质作检测,诱导3 h后caspase-1蛋白得到剪切,5 h开始降解。研究结果表明,caspase-1基因可在大肠杆菌BL21中诱导表达,并且能够进行自我剪切。     

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因(BmGSTd1)的诱导表达定量分析

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)在机体的解毒代谢和抗氧化中起重要作用。为探究家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因(BmGSTd1)在家蚕体内的解毒和抗性功能,采用实时荧光定量PCR方法,对BmGSTd1基因在正常饲养及添食NaF家蚕5龄幼虫不同组织中的转录水平进行检测,并采用家蚕Actin3、GAPDH、28S rRNA 3种内参照基因对检测结果进行归一化处理。BmGSTd1基因在家蚕5龄幼虫各组织的转录水平存在差异,且采用不同内参照基因结果不一致:分别以家蚕Actin3、GAPDH、28S rRNA基因为内参照,该基因转录水平最高的组织分别为中肠、丝腺、脂肪体。5龄第2天幼虫添食NaF对体内各组织中BmGSTd1基因的转录水平具有诱导作用,且在不同组织中诱导表达的情况不同,采用以上3种内参照基因进行归一化处理的结果数据表明,中肠和脂肪体组织中的诱导转录水平最高,可能与这2种组织是家蚕主要的解毒器官有关。研究认为,检测基因在不同组织中的转录水平,采用合适的内参照基因对保证检测结果的可靠性非常重要。