环境激素阿特拉津对家蚕卵巢培养细胞(BmN)凋亡的影响

为探讨利用鳞翅目昆虫对环境激素进行生物学评价和监测的方法,用2,3-二苯基溴化四唑(MTT)、4’,6二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色和单细胞凝胶电泳(SCGE)、流色细胞仪检测(FCM)等技术,分析检测了环境激素阿特拉津(AT)对体外培养家蚕卵巢细胞(BmN)细胞增殖和凋亡的影响。结果显示：AT浓度超过0．0625mmol/L,显著抑制了BmN培养细胞48h的存活率(p＜0．001),LC_(50)为0．0703mmol/L;0．0625～0．5000mmol/L AT处理24h后,BmN细胞核出现明显的凋亡现象;0．5000mmol/L的AT处理48h后,BmN细胞DNA链发生断裂。AT对BmN细胞增殖和凋亡的影响有明显的时间-剂量效应。长期处于AT污染的环境中对鳞翅目昆虫可能有严重的细胞毒性。     

35℃高温对家蚕BmN细胞生长发育的影响

利用 3 5℃高温对家蚕 Bm N细胞进行不同时间、时期的处理 ,结果表明 3 5℃高温对家蚕Bm N细胞生长发育影响最为敏感的时期是继代后 0～ 2 4h与细胞倍增时期 (约为继代后的 48～ 72 h)。3 5℃高温处理均明显抑制了家蚕 Bm N细胞的正常生长发育。始终处于 3 5℃高温处理下的家蚕 Bm N细胞表现出停止生长、死亡 ,进而部分破碎。     

F-2毒素致体外培养大鼠睾丸支持细胞DNA损伤

为探讨F-2毒素对雄性生殖机能的影响,取大鼠睾丸支持细胞进行体外培养,运用单细胞凝胶电泳技术检测51、0、20和40 mg/L的F-2毒素攻毒后24 h支持细胞DNA的损伤情况。结果显示,F-2毒素在一定浓度范围内对体外培养的支持细胞DNA产生损伤作用,且受损程度随着F-2毒素攻毒剂量而升高,具有明显量效关系。除5 mg/L剂量组外,其余各组的细胞受损率、彗星尾长和DNA损伤程度与阴性对照组相比差异极显著（P〈0.01）,表明F-2毒素对体外培养的大鼠睾丸支持细胞有毒性作用,能够损伤细胞DNA。     

家蚕核型多角体病毒编码miR-364对DNA聚合酶基因表达的调控作用研究

MicroRNA(miRNA)在调控病毒与宿主相互作用方面起着重要作用。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)编码的miRNA对其自身靶基因的调控作用,通过高通量测序得到Bm NPV编码的一条miRNA——Bm NPV-miR-364,利用在线靶基因预测程序RNAhybrid与RNA22预测Bm NPV基因组中有6个基因可能是Bm NPV-miR-364的靶基因。分别构建Bm NPVmiR-364与6个侯选靶基因3'-UTR的表达载体,共转染Bm N细胞后检测其双荧光素酶活性,结果表明Bm NPV-miR-364对Bm NPV DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的抑制作用显著(P0.05),对其余5个靶基因的抑制作用不显著。进一步采用Bm NPV-miR-364 mimic与Bm NPV-miR-364 inhibitor分别进行过表达和缺失表达分析,显示Bm NPV-miR-364 mimic能显著抑制DNA polymerase基因的表达,而Bm NPV-miR-364 inhibitor能显著解除Bm NPV-miR-364对DNA polymerase基因的抑制作用。将Bm NPV-miR-364与DNA polymerase基因的表达载体共转染Bm N细胞,qRT-PCR分析发现实验组细胞中病毒DNA polymerase基因的表达水平显著低于对照组。qRT-PCR检测家蚕经口接种Bm NPV后24 h内,血淋巴中Bm NPV-miR-364和病毒DNA polymerase基因的表达量很低,但在24 h之后表达量急剧上升。研究结果提示:Bm NPV编码的miR-364可以靶向抑制自身复制过程中的重要酶基因,调节DNA的复制。     

阿维菌素对家蚕血细胞DNA变异的影响

利用RAPD标记技术检测杀虫剂阿维菌素对家蚕血细胞DNA的损伤,作为评价其对蚕体毒性的依据。分别用1、2、4、8μg/L阿维菌素药液处理的桑叶给4龄起蚕添食,96 h后对家蚕血细胞的基因组DNA进行RAPD分析。24条RAPD引物对5个样品基因组DNA扩增产生的清晰条带数为143条,其中多态性片段19条,多态性带数比率为13.29%。用Ntsyspc 2.1软件计算出不同处理样品血细胞DNA间的遗传相似系数分布在0.867～0.993,树状聚类图显示正常样品与1、2、4μg/L阿维菌素药液处理的3个样品聚为一类,而8μg/L阿维菌素药液处理的样品单独聚为一类,说明该样品血细胞DNA的变异最大。研究结果提示,RAPD标记作为杀虫剂对家蚕的毒性检测标志技术,可准确预警蚕区农药使用对养蚕生产存在的潜在危害。     

人类免疫缺陷病毒HIV结构蛋白Gag在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

人类免疫缺陷病毒(HIV)是导致艾滋病的主要病原之一,HIV病毒的核心结构蛋白Gag有自我装配功能,并能激发体液免疫和细胞免疫,是理想的HIV疫苗靶抗原。将Gag基因克隆至质粒p Bac PAK8中构建重组质粒,并与线性化的家蚕杆状病毒基因组DNA共转染Bm N细胞,得到重组家蚕杆状病毒Bm NPV-Gag。将该重组病毒感染Bm N细胞和家蚕5龄幼虫,SDS-PAGE、Western blotting检测显示在重组病毒感染的Bm N细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中均有与Gag蛋白大小(55 k D)相符的特异性条带出现,证明重组Gag蛋白成功表达。用ELISA法测定重组病毒感染后不同时间目的蛋白质的表达变化:Bm N细胞中的Gag蛋白含量在感染后的第4天达到最大值6.995 pg/个,在感染第5天后出现下降趋势;5龄幼虫血淋巴中的Gag蛋白含量在感染后的第7天最高,为790.1 ng/m L。重组Gag蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达,为艾滋病疫苗的研究探索了新的途径。     

家蚕miR-0047对丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用研究

对家蚕中部丝腺小RNA高通量测序获得若干新miRNA,生物信息学分析发现Bmo-miR-0047可能对家蚕丝胶蛋白基因Bm Ser-1有调控作用。设计特异性茎环引物,利用半定量RT-PCR检测分析家蚕5龄3 d幼虫丝腺(包括前、中、后部丝腺)、头部、脂肪体、表皮、中肠、马氏管、精巢/卵巢、血淋巴细胞和气管等12个器官组织中Bmo-miR-0047的表达情况。结果显示,中部丝腺中Bmo-miR-0047的相对表达量明显高于其他组织,说明在家蚕5龄幼虫期Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因的表达调控存在时空特异性。为了进一步分析Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因表达的调控作用,构建重组表达载体pc DNA3.0(ie1-egfp-pri-miR-0047-SV40)和p GL3(A3-luc-Bm Ser-1 3'UTR-SV40),并以海肾荧光素酶报告质粒pRL-CMV为内参,利用家蚕卵巢培养细胞Bm N进行共转染。转染后检测发现实验组Bm N细胞中的荧光素酶活性与对照组相比显著减弱,表明Bmo-miR-0047在体外培养细胞中对Bm Ser-1基因的表达具有负调控作用。     

纳米银对家蚕核型多角体病毒和青枯劳尔氏菌的杀灭作用

纳米银是以纳米技术研制的一种新型消毒杀菌剂。选择家蚕血液型脓病病原家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)和桑青枯病病原菌青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)2种蚕桑生产上重要的病原微生物,用纳米银进行处理,测试与分析纳米银对2种病原物的杀灭效果及作用机制。用透射电子显微镜观察经0.2 mg/L纳米银溶液处理24 h后Bm NPV多角体的包被蛋白受到破坏,裸露的病毒粒子被纳米银粒子进一步杀灭;家蚕4龄幼虫用经过纳米银溶液处理的Bm NPV多角体悬液添食后,至5龄末期无感染症状,证实了Bm NPV的多角体结构被破坏而失去感染活性。用琼脂糖凝胶与SDS-PAGE电泳技术检测青枯劳尔氏菌经0.2 mg/L纳米银溶液处理24 h后的核酸和蛋白质变化,结果显示:菌体基因组DNA电泳条带呈现拖带现象,菌体蛋白质条带变得杂乱、不完整,说明菌体的DNA及蛋白质的分子结构被纳米银粒子破坏和部分降解。试验结果从病原的结构和分子水平证明了纳米银对上述2种病原物有杀灭作用。     

慧星试验检测洛克沙胂对CHL细胞的DNA损伤

利用碱性单细胞凝胶电泳技术研究洛克沙胂对中国仓鼠肺细胞(CHL)的DNA损伤影响。洛克沙胂分为10、100、500、1000mg/L剂量组,分别以磷酸盐缓冲液和10mg/L亚砷酸钠为对照组,经3、6、12、24、48h暴露后进行单细胞凝胶电泳。结果表明,慧星试验参数尾DNA含量、慧星全长、慧尾长、尾距和Olive尾距等表现出剂量-效应、时间-效应关系,不同剂量洛克沙胂、不同暴露时间下对CHL细胞有不同程度的DNA损伤。     

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。     

家蚕核型多角体病毒Bm90基因缺失对病毒增殖和组装的影响

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)基因组中的orf90基因(Bm90)是一个未知功能的保守基因。利用λRed重组系统和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒Wt Bacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfpBacmid及Bm90基因补回型病毒Bm90re-polh-egfp-Bacmid,并制备Bm90蛋白的多克隆抗体,研究Bm90基因在病毒感染周期中的表达以及对病毒增殖和组装的影响。将3种重组病毒分别转染Bm N细胞,Western blot检测显示Bm90蛋白在病毒转染Bm N细胞后72 h有表达;但用荧光显微镜观察Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有出现绿色荧光,且检测其病毒滴度为0;用透射电子显微镜观察在Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有子代病毒粒子出现。研究结果表明,Bm90基因缺失会抑制子代病毒粒子的组装和产生,使病毒失去侵染性,Bm90基因是病毒增殖及组装的必需基因。     

40%丙溴·辛硫磷—保桑灵在桑树生长期使用对家蚕安全间隔期试验报告

我县几年来农药使用单一,原有农药对虫害防治效果已不明显,本试验目的是测试40%丙溴.辛硫磷—保桑灵(以下统称40%丙溴·辛硫磷)三个不同浓度(1000倍、1250倍、1500倍)对家蚕安全间隔期及对桑树的安全性,为我县桑虫害防治寻找新农药,结合原有农药交替使用达到最佳防治。试验表明:三个不同浓度药液喷施桑树后,当天采叶喂收蚁第一天,蚕儿全部死亡;24h后采叶喂蚕也全部死亡;48h后采叶喂蚕出现一部分蚕儿萎缩死亡现象;72h后采叶喂蚕无异常现象。喷药6天后,喂3龄饷食蚕一直到上蔟累计死亡率均为零。说明40%丙溴.辛硫磷对家蚕的毒性随着喷药后间隔时间的加长死亡率趋向变低,建议使用浓度为1000~1500倍,采桑喂蚕的安全期为5~7天。     

家蚕核型多角体病毒基因bm64的表达及定位分析

对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)功能未知基因的研究,有利于全面揭示病毒的复制和感染机制。依据NCBI数据库发表的Bm NPV T3株基因组序列(Gen Bank登录号:L33180.1),选择未知功能基因bm64进行生物信息学分析,该基因ORF全长333 bp,编码110个氨基酸,预测蛋白质分子质量为12.71 k D,等电点4.21。将Bm64蛋白亲水区1~49 aa的编码序列与原核表达载体p GEX-4T-3连接,构建重组表达质粒,转化E.coli Rosetta菌株后进行诱导表达。SDS-PAGE检测在预测分子质量处有明显的蛋白质条带,纯化该蛋白质并以此为抗原免疫新西兰大白兔,制备Bm64蛋白多克隆抗体。在病毒感染Bm N细胞后24 h即可用Western blot方法检测到Bm64蛋白的表达。通过间接免疫荧光检测到Bm64蛋白在Bm NPV感染的Bm N细胞中表达,并定位于细胞核。研究结果为进一步分析家蚕核型多角体病毒bm64基因的功能奠定了实验基础。     

氮乙酰半胱氨酸对家蚕辛硫磷农药中毒的预防作用

氮乙酰半胱氨酸(NAC)是谷胱甘肽的前体物质,能脱乙酰基生成半胱氨酸并具有很强的抗氧化作用。给家蚕5龄起蚕连续24 h添食200μg/mL NAC后,再连续24 h添食0.5倍半致死浓度(4μg/mL)的辛硫磷药液,检测家蚕体内蛋白质、碳水化合物含量和相关解毒酶活性以及还原型谷胱甘肽(GSH)代谢的变化,探究NAC对家蚕辛硫磷农药中毒的预防效果。试验结果表明:预添食NAC能显著提高辛硫磷中毒5龄幼虫的体质量和存活率(P0.05);能显著提高辛硫磷中毒家蚕产茧的全茧量、茧层量、茧层率和上茧率(P0.05);能有效缓解辛硫磷中毒家蚕血液蛋白质和碳水化合物含量的下降,能使超氧化物歧化酶(SOD)活性在更短时间内被激发,羧酸酯酶(ESTs)的活性上升至仅用辛硫磷处理组家蚕的1.64倍,并且能有效缓解辛硫磷对过氧化物酶(POD)活性的抑制作用;能促进家蚕体内的GSH代谢,激发谷胱甘肽合成酶(GSTs)的活性等。依据试验结果初步认为,NAC通过促进家蚕体内相关生化代谢活动,激发相关解毒酶的活性,从而提高蚕体对亚致死剂量辛硫磷毒性的抵抗能力。     

镉致鸡脾脏淋巴细胞DNA损伤的研究

应用片段化DNA定量分析法和碱性单细胞凝胶电泳法，检测了10／μmol／L镉对体外不同时间培养的鸡脾脏淋巴细胞DNA损伤的情况，结果表明：10μmol／L的镉能够明显损伤鸡脾脏淋巴细胞DNA，并且呈现时间效应。提示镉致淋巴细胞DNA损伤是镉对禽类免疫毒性的重要机制之一。     

钼对TM3小鼠睾丸间质细胞周期和凋亡的影响

以体外培养的小鼠睾丸间质细胞系TM3 为材料,加入不同质量浓度的钼酸钠溶液（0,10,20,40,80,160mg/L）染毒培养,分别在干预4,8,12,24,48h采用MTT法检测细胞的增殖。干预48h后,采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的变化。结果表明：与对照组相比,不同剂量钼酸钠作用24h后,睾丸间质细胞的增殖活性均受到抑制;不同质量浓度的钼酸钠作用48h后,细胞周期阻滞于G0/G1期,20mg/L及其以上剂量组G0/G1期细胞百分率与对照组相比显著升高（P〈0.05或P〈0.01）;与对照组相比,各剂量组TM3 小鼠睾丸间质细胞凋亡率显著升高,差异极显著（P〈0.01）;细胞尾部DNA含量及细胞尾长随着钼剂量的增加呈不同程度的增加,且存在着剂量—效应关系。结论说明钼能够引起睾丸间质细胞周期的紊乱,并诱导睾丸间质细胞发生DNA损伤和凋亡。     

桑叶农药残留的酶抑制速测与生物检测比较

采用家蚕生物毒性测定方法验证CL-B Ⅲ残留农药测定仪检测桑叶农药残留,建立了两种方法对十余种常用有机磷和氨基甲酸酯类农药的对应关系。结果表明：随着桑叶添毒时间的延长,家蚕死亡率和残留农药测定仪的检测抑制率均呈现下降趋势,绝大部分农药对家蚕的死亡率与检测抑制率之间同步性较好,但乙酰甲胺磷的检测抑制率明显偏低,易出现假阴性结果。因此,酶抑制速测法可作为养蚕前桑叶农药残留粗筛检测,也可在家蚕中毒事故发生后作为判断农药种类的快速检测方法。     

钼对TM3小鼠睾丸间质细胞周期和凋亡的影响

以体外培养的小鼠睾丸间质细胞系TM3 为材料,加入不同质量浓度的钼酸钠溶液(0,10,20,40,80,160mg/L)染毒培养,分别在干预4,8,12,24,48h采用MTT法检测细胞的增殖。干预48h后,采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的变化。结果表明:与对照组相比,不同剂量钼酸钠作用24h后,睾丸间质细胞的增殖活性均受到抑制;不同质量浓度的钼酸钠作用48h后,细胞周期阻滞于G0/G1期,20mg/L及其以上剂量组G0/G1期细胞百分率与对照组相比显著升高(P<0.05或P<0.01);与对照组相比,各剂量组TM3 小鼠睾丸间质细胞凋亡率显著升高,差异极显著(P<0.01);细胞尾部DNA含量及细胞尾长随着钼剂量的增加呈不同程度的增加,且存在着剂量—效应关系。结论说明钼能够引起睾丸间质细胞周期的紊乱,并诱导睾丸间质细胞发生DNA损伤和凋亡。     

BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析

从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。     

Bm59基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制、转录及组装的影响

Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-egfp,并分别转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,研究Bm59基因在病毒侵染、增殖和组装中的功能。对病毒滴度的检测结果表明3种类型病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值均显著低于其他2种类型病毒(P0.05)。电子显微镜下观察Bm59ko-Bacmid-polh-egfp转染的细胞中只有少量细长的杆状病毒粒子,而其他2种类型病毒转染细胞后则能产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qRT-PCR检测结果显示,Bm59缺失型病毒基因组DNA的复制能力显著降低(P0.05),早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著低于野生型病毒(P0.05)。综上所述,Bm59基因虽然是家蚕核型多角体病毒复制的非必需基因,但会显著影响病毒的增殖速度和病毒粒子的组装,对病毒各个时期的基因转录水平具有下调作用。