绵羊γ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及产物的抗病毒活性

干扰素(IFN)具有广谱的抗病毒作用,利用杆状病毒表达系统安全、高效和后加工过程完整的特点,在家蚕体内表达生产重组绵羊γ干扰素(Ovi IFN-γ)。依据家蚕的密码子偏好性对Ovi IFN-γ基因核苷酸序列进行优化和PCR,并克隆了带有His标签编码序列的Ovi IFN-γ基因序列Ovi IFN-His-Tagged-γ,构建分别插入Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ基因的重组病毒。将2种重组病毒感染家蚕5龄幼虫,Western blot检测蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ和Ovi IFN-His-Tagged-γ成功表达。采用细胞病变抑制法测定蚕体血淋巴中重组Ovi IFN-γ的效价为1.6×106U/m L,重组Ovi IFN-His-Tagged-γ的效价为2.8×105U/m L,前者的抗病毒活性强于后者,稀释至2.0×104倍时,能够完全抑制VSV-GFP病毒感染。上述结果为利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内高效、安全生产具有抗病毒活性的重组绵羊γ干扰素提供了试验依据。     

家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测

DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达人γ干扰素及产物的抗病毒活性检测

干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用.利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的序列克隆到杆状病毒转移载体pBR中,然后与orf1629基因缺失的失活拯救型杆状病毒BmBacmid共转染BmN细胞,获得重组病毒reBmBac-hIFN-γ,最后利用获得的重组病毒感染家蚕并收获表达产物.采用微量细胞病变抑制法,在Vero/VSV-GFP系统中检测到重组hIFN-γ 的效价达到(3.69±2.02)×106 IU/mL.此外,重组hIFN-γ可以抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖.上述结果为利用家蚕生物反应器高效生产具有活性的人γ干扰素奠定了试验基础.     

猫ω干扰素基因的克隆表达及其活性测定

根据已知人、马、牛、羊、兔、鹿等物种体内IFNω的基因序列分析,设计引物进行扩增。将扩增基因克隆于原核表达载体pET-His。将重组表达载体转入宿主菌进行诱导表达,表达产物以包涵体的形式存在,大小约为20kDa,表达量达到28%。将表达产物复性纯化处理后加入猫肾上皮细胞（CRFK）,用水泡性口炎病毒（VSV）攻毒,测出重组IFNω的生物活性达到1.64×106U/mg,重组蛋白质的含量约为18mg/L。     

猫干扰素ω3与胸腺肽α1融合蛋白表达及活性检测

依据猫IFN-ω3和THY-α1的分子结构特征及大肠杆菌密码子的偏爱性设计引物,同时在IFN-ω3和THY-α1中间设计了1个(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)×3总共15肽的linker.采用搭桥PCR方法获得二者的融合基因.将该基因克隆至pBVIL载体中,构建了pBVIL-IFNω3-THYα1原核表达载体.将重组栽体转化至Rosseta(DE3)细胞中,经过IPTG诱导表达及蛋白质分离纯化,获得了质量浓度为0.78 g/L的IFNω3-THYα1融合蛋白.经E玫瑰花环形成试验和细胞病变抑制试验,结果表明E玫瑰花环形成率平均为23.4%,融合蛋白的活力值为7.4%,细胞病变抑制试验同阳性对照组结果基本一致,融合蛋白中的IFNω3、THYα1均较好地保持各自的生物活性,为IFNω3-THYα1融合蛋白进一步的开发和应用奠定了基础.     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素和λ1干扰素

牛干扰素可用于对各种类型牛传染性疾病的预防和治疗。利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素(BoIFN-α)及牛λ1干扰素(BoIFN-λ1)。首先对BoIFN-α和BoIFN-λ1的编码基因序列进行优化合成,优化合成的BoIFN-α和BoIFN-λ1基因的密码子适应指数(CAI)值提高,更适合在家蚕中表达,且翻译后的氨基酸序列与原始氨基酸序列完全一致。将优化合成的2个基因序列分别克隆至杆状病毒转移载体pVL1393,与缺失了orf1629的亲本杆状病毒BmBacmid共转染Bm N细胞,通过同源重组将BoIFN-α和BoIFN-λ1基因插入到杆状病毒多角体蛋白基因启动子下游,获得重组病毒rBmBac-BoIFN-α和rBmBac-BoIFN-λ1。用纯化的重组病毒感染家蚕5龄幼虫融合表达BoIFN-α和BoIFN-λ1干扰素,并通过PCR鉴定了2个目标蛋白基因在蚕体内的复制。采用微量细胞病变抑制法在Vero/VSV*GFP表达系统检测蚕体中表达重组BoIFN-α的效价可达1.0×10~6U/mL左右,重组BoIFN-λ1的效价可达5.01×10~4U/m L左右。试验结果提示,利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内表达牛α干扰素及牛λ1干扰素是生产牛干扰素制剂更加廉价而高效的途径。     

增强型猫ω干扰素的筛选及抗病毒活性分析

为获得增强型猫ω干扰素(FeIFN-ω),本研究通过分子对接方法预测和参考相关位点研究,设计3组定点突变引物.以pJET-FeIFN-ω为模板分别扩增FeIFN-ω基因及其3个突变基因(FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R),并连接慢病毒载体pLVX-IRSE,构建重组质粒p...     

猫ω干扰素研究进展

随着对猫ω干扰素的研究不断深入,因其较高的抗病毒、抗增殖和抗肿瘤效果、以及免疫调节作用,引起了人们的广泛关注与研究。论文结合了ω干扰素相关研究结果,综述了猫ω干扰素的结构特征、生物学活性以及抗病毒的作用机制,综合分析了其在临床上对FCV、FHV-1、FIV、FCGS及FIP等几种常见猫病毒病的治疗效果,以期为临床上寻求新型有效的动物抗病毒药物提供依据,为探索使用猫ω干扰素治疗其他其他动物病毒病奠定重要的理论基础与实验佐证,为开发以猫ω干扰素为基础更高效的基因工程干扰素制品提供了新思路。     

猫ω干扰素研究进展

<正>1957年,Issacs和Lindermann将灭活的流感病毒与鸡胚绒毛尿囊膜一起培养,发现了一种可溶性物质,该物质作用于其他鸡胚绒毛尿囊膜时,可以抑制流感病毒的复制,因此把这种物质命名为干扰素(Interferon,IFN)^[1]。IFN是机体天然免疫防御系统中的一类重要的细胞因子^[2],它的主要功能包括抗病毒、抗肿瘤和免疫调节,也是目前被应用最多的3个特性^[3]。根据干扰素的结构、序列、染色体上的位置和受体特异性,可以将其分为三类,即Ⅰ型干扰素、Ⅱ型干扰素和Ⅲ型干扰素^[4]。Ⅰ型干扰素已发现IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε等,Ⅱ型干扰素目前只发现了IFN-γ^[2],Ⅲ型干扰素目前发现了IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3,Ⅲ型干扰素的许多功能同Ⅰ型干扰素是类似的^[5,6]。     

猫ω干扰素和γ干扰素的可溶性原核表达及纯化

旨在克隆到猫ω干扰素和γ干扰素(FeIFN-ω和FeIFN-γ)基因的基础上,分析它们的一些生物学特性,并进行可溶性原核表达和简化纯化工艺,为后期作为抗病毒药物的开发奠定基础.根据GenBank登录的FeIFN-ω和FeIFN-γ基因序列,对其编码氨基酸的信号肽序列进行分析,设计引物用于克隆不包含信号肽的成熟蛋白基因序...     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素

人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。     

轮状病毒结构蛋白VP4在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

轮状病毒(rotavirus,RV)是引起全球婴幼儿及幼畜非细菌性胃肠炎的主要病原体之一,VP4蛋白是轮状病毒的主要中和抗原。利用载体RD-BmBacmid与重组载体pBacPAK8-VP4共转染家蚕细胞BmN获得重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP4,并用该病毒感染BmN细胞及家蚕5龄幼虫,从而在BmN细胞及家蚕中表达TB-Chen株轮状病毒的VP4蛋白。Western blotting检测到BmN细胞及家蚕幼虫血淋巴中均出现88 kD的特异性条带,证明VP4蛋白在BmN细胞和家蚕中获得了表达。ELISA检测结果显示,VP4蛋白在BmN细胞和家蚕幼虫血淋巴中的表达分别在感染后4 d和6 d达到最高水平,每个细胞和每mL血淋巴中的表达量分别为4.28 pg和1.61μg。研究结果为轮状病毒口服疫苗的研制奠定了基础。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

家蚕Polh+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建

为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。     

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡-γ-干扰素（Chicken interferon-γ，ChIFN-γ）的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光（1FA）及间接ELISA检测，表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示，重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制。而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明，重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ，并具有高效抗病毒活性。     

蜂素信号肽介导猪干扰素-γ在杆状病毒中分泌表达及抗病毒活性检测

应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟的猪干扰素-γ基因插入供体质粒pFastBacTM1polyhedrin启动子控制下的多克隆位点,引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(Honeybee melittin signal peptide)取代猪干扰素-γ原有信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组蛋白通过SDS-PAGE、间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性是1.38×106U/mL。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。