家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38与家蚕SRSF蛋白激酶的相互作用关系验证

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SRPK)之间存在互作关系,推测Bm NPV可能是通过影响宿主的前体mRNA组成性和选择性剪接来获得对自身增殖有利的微环境。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析感染Bm NPV后Bm N细胞中Bm SRPK的表达变化以及正常家蚕5龄第3天幼虫体内Bm SRPK表达的组织特异性,发现感染病毒后Bm N细胞中Bm SRPK的表达量有所增加;Bm SRPK在正常幼虫的精巢、中肠和脂肪体中表达量较高,在血细胞中的表达量最低。研究结果有助于进一步深入研究Bm NPV和家蚕宿主之间复杂的相互作用关系。     

BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析

从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。     

家蚕核型多角体病毒orf61基因缺失对病毒复制和各时期基因转录的影响

orf61是杆状病毒晚期表达的核心基因之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重组技术与Bac-to-Bac系统分别敲除和异位补回orf61基因,构建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及补回型病毒orf61-reBacmid,然后分别转染家蚕培养细胞Bm N,调查orf61基因缺失对Bm NPV复制和不同时期基因转录的影响。检测orf61基因缺失型病毒转染Bm N细胞液上清中的病毒滴度为0,说明orf61基因缺失导致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);荧光定量PCR分析orf61基因缺失会显著地降低病毒基因组的复制水平,进而导致病毒各个时期基因转录水平极显著下降(P0.01)。此外,通过体外EMSA试验和构建双荧光素酶报告基因系统,检测ORF61蛋白对多角体蛋白基因polh启动子的调控作用,结果显示该蛋白质是polh基因转录的负调节因子。研究结果有助于深入阐释Bm NPV orf61基因在病毒基因组复制中的作用以及对极晚期表达的多角体蛋白基因polh的转录调控作用。     

家蚕核型多角体病毒Bm90基因缺失对病毒增殖和组装的影响

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)基因组中的orf90基因(Bm90)是一个未知功能的保守基因。利用λRed重组系统和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒Wt Bacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfpBacmid及Bm90基因补回型病毒Bm90re-polh-egfp-Bacmid,并制备Bm90蛋白的多克隆抗体,研究Bm90基因在病毒感染周期中的表达以及对病毒增殖和组装的影响。将3种重组病毒分别转染Bm N细胞,Western blot检测显示Bm90蛋白在病毒转染Bm N细胞后72 h有表达;但用荧光显微镜观察Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有出现绿色荧光,且检测其病毒滴度为0;用透射电子显微镜观察在Bm90基因缺失型病毒转染的Bm N细胞中没有子代病毒粒子出现。研究结果表明,Bm90基因缺失会抑制子代病毒粒子的组装和产生,使病毒失去侵染性,Bm90基因是病毒增殖及组装的必需基因。     

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。     

家蚕核型多角体病毒多角体蛋白的多克隆抗体制备及应用试验

杆状病毒(baculovirus)多角体蛋白(polyhedrin)是晚期高水平表达的蛋白质,对于维持病毒粒子在自然环境下的稳定性和在宿主之间的传播至关重要。PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)多角体蛋白基因polh,亚克隆到原核表达载体p ET32,获得重组质粒p ET32-polh,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)表达菌株进行原核表达,诱导表达的融合蛋白带His标签,经镍柱纯化后用于免疫新西兰大白兔,制备抗多角体蛋白的多克隆抗体。Western blot检测该多克隆抗体能够特异识别Bm NPV的多角体蛋白。利用该多克隆抗体进行免疫荧光和Western blot分析多角体蛋白的亚细胞定位及表达时相,结果显示多角体蛋白定位于细胞质,且在病毒感染后48 h才可以被检测到。该多克隆抗体可用于Bm NPV多角体蛋白的功能研究。     

家蚕胸腺素对蚕体抗核型多角体病毒感染能力的影响

胸腺素(THY)在动物进化过程中高度保守,并在许多生命活动中发挥重要作用。将家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)感染家蚕5龄幼虫后,分别提取蚕体及不同组织的RNA和蛋白质,检测Bm THY基因的转录及蛋白质表达的变化,并探究利用重组胸腺素r Bm THY增强家蚕抗病毒能力的可行性。qRT-PCR检测结果表明,感染Bm NPV后的家蚕5龄幼虫,其血淋巴、脂肪体、丝腺和气管中的Bm THY基因mRNA转录水平不同程度上调,而马氏管、中肠和头部组织中Bm THY基因mRNA转录水平则呈下调趋势;Western blotting检测家蚕5龄幼虫感染Bm NPV后72 h,蚕体内Bm THY蛋白的表达水平下降42.3%。家蚕5龄幼虫接种Bm NPV后,分别添食质量浓度为340μg/m L(高剂量)、34μg/m L(中剂量)和3.4μg/m L(低剂量)的r Bm THY溶液,调查3组幼虫的发病率为43.8%、54.0%和57.6%,而对照组幼虫分发病率为62.2%。研究结果初步证明Bm NPV感染可降低蚕体及部分组织中Bm THY的基因转录与蛋白质表达水平,高剂量r Bm THY添食处理可以在一定程度上提高家蚕抗Bm NPV病毒感染的能力。     

家蚕核型多角体病毒广东分离株Bm126基因编码基序RGD的功能研究

杆状病毒因专一感染昆虫而作为治理农林害虫的生物农药以及作为表达载体在生物医药产业得到广泛应用。前期研究发现家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)中国广东分离株(Bm NPV-GD)的orf126基因(Bm126)包含一个编码精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的基序。采用点突变技术构建RGD编码基序突变的转移载体,利用Bm NPV Bac-to-Bac系统转座获得重组bacmid,通过转染Bm N细胞获得重组病毒,分析突变病毒在感染细胞后期的多角体产量变化,并在病毒感染过程中进一步应用RGD竞争性多肽Cyclo[RGDf-N(Me)V-]分析突变病毒多角体产量的变化,以此探究Bm NPV Bm126编码的RGD基序是否在病毒感染增殖中发挥作用。经t检验统计表明突变病毒感染Bm N细胞后产生的多角体数量与对照病毒没有显著性差异,Cyclo[RGDf-N(Me)V-]处理结果也显示其与对照没有显著差异,表明Bm NPV-GD Bm126基因编码的RGD基序可能不是直接参与病毒感染宿主细胞后的增殖过程,而是辅助病毒的其他因子与宿主细胞互作。     

家蚕核型多角体病毒编码miR-364对DNA聚合酶基因表达的调控作用研究

MicroRNA(miRNA)在调控病毒与宿主相互作用方面起着重要作用。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)编码的miRNA对其自身靶基因的调控作用,通过高通量测序得到Bm NPV编码的一条miRNA——Bm NPV-miR-364,利用在线靶基因预测程序RNAhybrid与RNA22预测Bm NPV基因组中有6个基因可能是Bm NPV-miR-364的靶基因。分别构建Bm NPVmiR-364与6个侯选靶基因3'-UTR的表达载体,共转染Bm N细胞后检测其双荧光素酶活性,结果表明Bm NPV-miR-364对Bm NPV DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的抑制作用显著(P0.05),对其余5个靶基因的抑制作用不显著。进一步采用Bm NPV-miR-364 mimic与Bm NPV-miR-364 inhibitor分别进行过表达和缺失表达分析,显示Bm NPV-miR-364 mimic能显著抑制DNA polymerase基因的表达,而Bm NPV-miR-364 inhibitor能显著解除Bm NPV-miR-364对DNA polymerase基因的抑制作用。将Bm NPV-miR-364与DNA polymerase基因的表达载体共转染Bm N细胞,qRT-PCR分析发现实验组细胞中病毒DNA polymerase基因的表达水平显著低于对照组。qRT-PCR检测家蚕经口接种Bm NPV后24 h内,血淋巴中Bm NPV-miR-364和病毒DNA polymerase基因的表达量很低,但在24 h之后表达量急剧上升。研究结果提示:Bm NPV编码的miR-364可以靶向抑制自身复制过程中的重要酶基因,调节DNA的复制。     

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)lef-11基因在病毒感染宿主细胞中的表达特征

杆状病毒晚期表达因子(late expression factor,LEF)是参与病毒基因组DNA复制和病毒基因转录调控的一个重要家族,该家族成员LEF-11为13 k D的小分子蛋白质。通过比对目前已经测序的63种杆状病毒基因组序列,发现LEF-11的编码基因lef-11在除宿主为双翅目昆虫的Cuni NPV外的所有杆状病毒基因组中都存在,暗示lef-11基因可能在包括家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)在内的杆状病毒复制过程中行使重要功能。通过RT-PCR检测和Western blotting分析lef-11基因及其编码蛋白质在Bm NPV侵染的家蚕卵巢培养细胞Bm N中的转录与表达时相,其转录本从侵染后6h开始持续表达,蛋白质从侵染后12 h开始持续表达。当利用DNA聚合酶特异抑制剂阿非迪霉素(aphidicolin)阻断Bm NPV病毒基因组DNA复制之后检测LEF-11的表达受到抑制,暗示LEF-11的表达起始于病毒DNA复制之后。以上结果表明:BmNPV lef-11基因在杆状病毒中非常保守,是一个晚期表达基因,可能不直接参与病毒的起始复制,而是参与病毒的大规模复制过程。     

Bm59基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制、转录及组装的影响

Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-egfp,并分别转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,研究Bm59基因在病毒侵染、增殖和组装中的功能。对病毒滴度的检测结果表明3种类型病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值均显著低于其他2种类型病毒(P0.05)。电子显微镜下观察Bm59ko-Bacmid-polh-egfp转染的细胞中只有少量细长的杆状病毒粒子,而其他2种类型病毒转染细胞后则能产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qRT-PCR检测结果显示,Bm59缺失型病毒基因组DNA的复制能力显著降低(P0.05),早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著低于野生型病毒(P0.05)。综上所述,Bm59基因虽然是家蚕核型多角体病毒复制的非必需基因,但会显著影响病毒的增殖速度和病毒粒子的组装,对病毒各个时期的基因转录水平具有下调作用。     

家蚕微孢子虫与其他蚕病病原的联合感染试验

调查家蚕微孢子虫(Nosema bomycis,简称Nb)分别与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)、家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)、家蚕肠道菌、苏芸金杆菌(Bt)和家蚕白僵菌联合感染家蚕时存在的拮抗情况。结果显示家蚕感染适量Nb后,再以其它病原感染家蚕,都具有一定的降低家蚕微粒子病发生效果,其中以Nb感染家蚕后再感染Bm NPV或Bm CPV的抑制效果较明显,但其他病原或其他感染方式对降低家蚕微粒子病发生的效果不明显。     

纳米银对家蚕核型多角体病毒和青枯劳尔氏菌的杀灭作用

纳米银是以纳米技术研制的一种新型消毒杀菌剂。选择家蚕血液型脓病病原家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)和桑青枯病病原菌青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)2种蚕桑生产上重要的病原微生物,用纳米银进行处理,测试与分析纳米银对2种病原物的杀灭效果及作用机制。用透射电子显微镜观察经0.2 mg/L纳米银溶液处理24 h后Bm NPV多角体的包被蛋白受到破坏,裸露的病毒粒子被纳米银粒子进一步杀灭;家蚕4龄幼虫用经过纳米银溶液处理的Bm NPV多角体悬液添食后,至5龄末期无感染症状,证实了Bm NPV的多角体结构被破坏而失去感染活性。用琼脂糖凝胶与SDS-PAGE电泳技术检测青枯劳尔氏菌经0.2 mg/L纳米银溶液处理24 h后的核酸和蛋白质变化,结果显示:菌体基因组DNA电泳条带呈现拖带现象,菌体蛋白质条带变得杂乱、不完整,说明菌体的DNA及蛋白质的分子结构被纳米银粒子破坏和部分降解。试验结果从病原的结构和分子水平证明了纳米银对上述2种病原物有杀灭作用。     

家蚕核型多角体病毒对两广二号和桂蚕N2创伤感染的差异性分析

以桑蚕抗性品种桂蚕N2和常规品种两广二号为对象,用昆虫针在蚕体表制造创口接种新采集的核型多角体病毒(Bm NPV),研究它们感染Bm NPV的差异。结果显示两广二号的Bm NPV创伤感染半数致死浓度(LC_(50))为2.46×10~6 PDV/m L,相当于脓病末期蚕血液稀释264倍的值,属于易感品种。而同等条件下桂蚕N2的LC_(50)为2.21×108PDV/m L,相当于稀释不到3倍的值,对核型多角体病毒耐受度显著高于前者,具有很强的抗核型多角体病毒创伤感染的能力。饲养桂蚕N2能显著减少蚕期创伤感染Bm NPV的几率。     

家蚕中肠细胞与家蚕核型多角体病毒经口感染因子P74的互作蛋白筛选

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)包涵体衍生型病毒粒子(ODV)被家蚕幼虫食下后通过侵染中肠上皮细胞引发全身性感染,这个过程称为经口感染。已知有多种ODV囊膜蛋白在经口感染中发挥关键作用,被称为经口感染因子(PIF)。P74作为最早被鉴定的PIF,与ODV结合中肠上皮细胞有关。为了鉴定宿主家蚕中肠细胞中与P74互作的蛋白质,构建家蚕中肠酵母文库,并以P74作为诱饵进行酵母双杂交筛选。初步筛选到7种互作候选蛋白,分别为U3小核仁核糖核蛋白IMP3、60S核糖体蛋白L5、JAB-MPN结构域蛋白、细胞质肌动蛋白A3、35 k D蛋白酶、富半胱氨酸和组氨酸蛋白1-B和真核翻译起始因子1A。免疫共沉淀实验结果表明JAB-MPN结构域蛋白和P74之间存在强烈互作,该蛋白质可能是ODV结合中肠细胞的关键宿主因子。研究结果为进一步阐明Bm NPV经口感染的详细分子机制提供了新的线索。     

家蚕核型多角体病毒(陕西株)orf126基因的表达及与几丁质的体外结合实验

为研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)orf126基因(Bm126)在感染宿主中的作用机制,采用PCR方法从BmNPV陕西株中克隆了切除N端23个氨基酸(预测信号肽序列)的Bm126基因,并将其和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合后在大肠杆菌中进行了表达。利用纯化的BM126重组蛋白与几丁质进行体外结合实验,Western blot分析没有检测到BM126重组蛋白与几丁质结合的复合物,推测原核表达的重组BM126融合蛋白在体外不能与几丁质结合。     

家蚕核型多角体病的抗性机制研究进展

家蚕核型多角体病毒(Bom byx m ori nuclearpo1yhedrosisvirus,Bm NPV)是昆虫病毒史上首先发现的,由Bm NPV引起的家蚕核型多角体病毒病是养蚕业三大病毒病中危害最为严重的一种。该病在世界养蚕业国家常有暴发,传染性极强,难以控制,危害最为严重在生产上,常造成巨大的经济损失。蚕业界学者多年来一直希望寻找抗病基因、阐明抗性机理、培育抗性品种,目前在很多领域己取得一定的进展。1杆状病毒及其侵染途径1.1杆状病毒分类及其相关基因的研究杆状病毒(baculovirus)是一类单分子双链闭合环状DNA病毒,基因组大小为88-160kb,因病毒粒子呈杆…     

家蚕核型多角体病毒增殖关键基因的鉴定

选择家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)基因组中可能与病毒增殖相关的8个基因dbp、lef-2、lef-3、lef-7、lef-10、lef-11、p143和vp1054作为候选基因,利用家蚕内源性microRNA骨架构建候选基因的干扰载体,并采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对上述候选基因进行干扰试验,筛选病毒增殖的关键基因,以期为开辟家蚕抗Bm NPV研究新路径打下基础。对8个候选基因的RNA干扰试验显示:干扰lef-7对Bm NPV的增殖没有明显影响;对lef-2和lef-11表达的干扰效率最高,达到90%以上,其中干扰lef-11后病毒对细胞的感染率仅为9.16%,远远低于对其他基因干扰后的感染率。依据试验结果初步确认8个病毒增殖相关基因中,lef-11对病毒增殖的影响最大。     

重要外文学术期刊发表蚕学论文简介

正1 KOKUSHO R,KOH Y,FUJIMOTO M,SHIMADA T,KATSUMA S.Bombyx mori nucleopolyhedrovirus BM5 protein regulates progeny virus production and viral gene expression.Virology,2016,498:240-249题目家蚕核型多角体病毒BM5蛋白参与了病毒增殖和病毒基因表达的调控摘要ORF5(Bm5)基因是家蚕核型多角体病毒(BmN PV)的核心基因,其编码蛋白质的C末端有1个DUF3627保守结构域。日本东京大学KOKUSHO等的研究表明,Bm5基因突变会导致出芽型病毒滴度降低和包涵体病毒数量减少,但是病毒基因组的复制没有受到影响。Bm5基因突变也会引起BmN PV其他基因     

利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统在BmN细胞中可溶性表达PRG-1蛋白

杆状病毒Bac-to-Bac表达系统由于操作简便等优点,被广泛应用于外源蛋白的表达。利用新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac系统可溶性表达一个大分子质量的融合蛋白———piwi相关基因编码蛋白PRG-1。为了提高目的蛋白的表达量,对重组病毒感染剂量及产物收获时间进行优化,并利用GST亲和层析纯化融合蛋白。结果表明在家蚕卵巢培养细胞BmN中表达的重组GST-PRG-1是可溶性蛋白;最佳的感染条件是病毒粒子对BmN细胞的感染复数(MOI)=1,并在感染后96 h收获细胞。试验结果表明,新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统可用于大分子蛋白的可溶性表达。