家蚕孤雌生殖系与有性生殖系亲本的血液比较蛋白质组学研究

为进一步解析家蚕孤雌生殖的发生机制,采用双向电泳(2-DE)、基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)和生物信息学技术,对高发生率和高孵化率的家蚕孤雌生殖系与其有性生殖系亲本的血液蛋白质组成进行比较分析。较其有性生殖系亲本,孤雌生殖系幼虫在5龄第3天、第5天和第7天血液中的差异蛋白不完全相同。对6个持续表达和差异明显的蛋白进行质谱分析,成功鉴定其中2个蛋白分别是保幼激素结合蛋白和胰凝乳蛋白酶抑制剂-8A,推测这2个蛋白及其余4个未被鉴定出的蛋白与2种生殖方式家蚕品系的生长发育、生殖等过程的调节有关联。     

抗保幼激素调控家蚕发育相关血液蛋白质组的初步分析

为探讨抗保幼激素调控家蚕发育的分子机理,以二化性蚕品种大造为材料,在4龄饷食时进行金鹿三眠素添食处理,并采用一维凝胶电泳/质谱(1-DE/MS)技术,分别对金鹿三眠素处理组和清水对照组不同发育阶段的雌蚕血液蛋白质进行了分离与鉴定,结果检测到与发育调控相关的差异蛋白质条带,质谱分析及数据库检索共获得了82个相匹配的候选蛋白质,剔除冗余部分后鉴定了其中的26个蛋白质组分;金鹿三眠素处理组4龄蚕血液蛋白质中,分子质量大小约为30 kD与70 kD的组分比较丰富,表达量变化类似于清水对照组5龄蚕,推测30 kD蛋白家族、血清蛋白BmLSP及其它差异表达组分可能与抗保幼激素调控的家蚕早熟变态有关。     

家蚕性别相关血液蛋白质组的一维电泳-液相色谱-质谱分析

分别从家蚕5龄幼虫和蛹期不同发育阶段提取雌、雄蚕血液总蛋白质,采用一维电泳-液相色谱-质谱(1DE-LC-MS)技术分析家蚕血液蛋白质的差异性表达及差异蛋白组分。在家蚕血液蛋白质含量与种类方面检测到与性别及发育相关的差异性表达,数据库检索结果共获得96个相匹配的候选蛋白质,剔除冗余部分后鉴定其中的27个蛋白质组分,分别属于13种蛋白质或其亚基。雌、雄蚕之间的差异组分主要出现在分子质量70~100 kD之间,其中芳基贮存蛋白、卵黄蛋白原、抗胰凝乳蛋白酶因子为雌特异性表达组分。30K蛋白家族是家蚕血液中高丰度表达的蛋白组分。这些差异蛋白质的鉴定与功能分析为研究家蚕性别发育调控机制提供了新的信息。     

细胞周期素家族基因在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中的转录特征

细胞周期蛋白(cyclin)是真核生物细胞有丝分裂的重要调节蛋白,家蚕具有5种类型细胞周期蛋白基因。以4龄将眠蚕、4龄眠蚕和5龄起蚕为材料,采用定量PCR方法分析5种细胞周期蛋白基因在4龄幼虫蜕皮过程的组织表达特征为:5种类型cyclin基因在生殖腺中都高表达,其中cyclinE在眠中表达量最高,其它4种类型cyclin基因在将眠时表达量最高,证实4龄眠期是家蚕生殖腺细胞发生有丝分裂的重要时期;5种类型cyclin基因在马氏管中都有表达,其中cyclinA和cyclinB3在4龄将眠蚕的马氏管中存在表达高峰,推测和马氏管内表皮更新相关;除cyclinL1在眠蚕丝腺的表达量很低外,cyclinA、cyclinB、cyclinB3和cyclinE在眠蚕丝腺中都存在表达高峰,可能和丝腺的内表皮更新相关;cyclinA、cyclinB、cyclinB3在脂肪体中的表达量较高,且在将眠时或眠中存在表达高峰,推测和脂肪体中能量物质的积累相关;5种类型cyclin基因在脑、血液和中肠的表达量都很低,且蜕皮前后的变化规律不明显。研究结果提示:在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中,cyclin基因的转录特征不仅和来源于外胚层组织的表皮更新相关,还和生殖腺的发育及脂肪体中能量物质的积累存在相关性。     

家蚕幼虫正常个体与眠性变化个体大眠蜕皮前后血液蛋白质差异表达分析

家蚕眠性既受染色体上主基因的控制,又受其它伴性成熟基因的调控,还受环境因素的影响。为了探讨环境因素改变家蚕眠性的分子机制,以四眠蚕品种898黄绿、D92黄绿和三眠蚕品种三眠A为材料,通过催青期或小蚕期温度、湿度、营养等因素的调控诱导眠性变化,利用双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)技术,对这些家蚕正常个体和眠性变化个体大眠蜕皮前后的血液蛋白质表达差异进行分析鉴定。结果共获得转铁蛋白、胰凝乳蛋白酶抑制剂SCI-I、多聚腺苷酸结合蛋白2、27 kD糖蛋白前体、核糖体蛋白L20和线粒体核糖体蛋白L2等13个上调或下调的可能与家蚕眠性相关的差异表达蛋白,为进一步从蛋白质水平深入了解家蚕眠性变化的机制奠定了基础。     

家蚕绵茧突变品系中部丝腺的差异蛋白组学分析

为了获取与家蚕绵茧突变形成相关蛋白质的基础信息,采用蛋白质双向电泳技术对结茧性状具有明显差异的正常茧、绵茧、丝胶茧3个家蚕品系5龄期幼虫中部丝腺不同区段的蛋白质进行双向电泳(2-DE)分析,图谱中的蛋白点主要集中在分子质量14～70 kD、等电点(pI)4～9的区域。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对部分表达量差异显著的蛋白点进行鉴定,获得35种可信的蛋白质,绵茧突变品系与正常茧、丝胶茧品系相比表达量有显著差异的蛋白质包括参与能量代谢、蛋白质合成等生物学过程的功能蛋白质,其中丝氨酸蛋白酶抑制剂16(serpin16)和丝氨酸蛋白酶抑制剂18(serpin18)可能与家蚕绵茧突变形成相关。     

农药氰戊菊酯和杀虫双诱导家蚕血液蛋白的变化

为了解析家蚕对常用农药氰戊菊酯和杀虫双的解毒机制,分别给家蚕5龄幼虫添食2种农药,观察家蚕对农药的中毒症状,采用双向电泳(2-DE)技术对添食农药的家蚕幼虫的血液蛋白进行分离,利用电喷雾电离(ESI)质谱对具有2次以上重复的显著差异蛋白点进行鉴定,并用生物信息学方法进行分析。家蚕5龄幼虫分别添食1/4LD50剂量浓度的2种农药后,均在3～12h内出现中毒症状,且血液蛋白的表达也发生了变化:在氰戊菊酯诱导下,幼虫血液中增加了纤维样蛋白、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂;在杀虫双诱导下,幼虫血液中增加了丝氨酸蛋白酶抑制剂-13;经2种农药分别诱导处理后3h,幼虫血液中都减少了体液低分子蛋白-Ⅲ的表达。推测家蚕对氰戊菊酯和杀虫双具有一定的免疫反应。     

家蚕幼虫消化液蛋白质组学分析

为了研究家蚕幼虫消化液的蛋白质组成情况,用双向电泳(2-DE)技术对家蚕幼虫消化液中的蛋白质进行了分离,随后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对其中的8个高丰度蛋白进行了鉴定,并用生物信息学方法进行了分析。结果显示:家蚕幼虫消化液中的蛋白质种类较少,分子量小,分布集中;在8个鉴定的蛋白点中,1个是30kP蛋白酶A原,5个是类胰蛋白酶,其它2个是碱性丝氨酸蛋白酶。     

家蚕翅原基发育关联基因BmHMGS的鉴定与表达特征分析

家蚕幼虫的翅原基最终发育为成虫的翅,翅原基发育与家蚕的变态发育紧密关联。为了研究激素作用下家蚕翅原基发育的分子调控机制,以经过蜕皮激素20E体外诱导培养和未经诱导培养的家蚕5龄幼虫翅原基为材料分别提取总蛋白质,利用Shotgun质谱分析在20E诱导组的翅原基中获得132种差异蛋白,在未经20E诱导组的翅原基中获得76种差异蛋白。进一步通过生物信息学技术及GO分类法在20E诱导组的翅原基的差异蛋白中,筛选到1个具有生物调节作用的酶类蛋白基因Bm HMGS作为翅原基发育相关的候选基因,设计引物并以上蔟1 d的蚕体翅原基总RNA反转录得到的c DNA为模板,克隆了该基因。通过qRT-PCR检测到Bm HMGS基因在幼虫5龄1 d、上蔟3 d、蛹期1 d蚕体内的表达量较高,其中在上蔟3 d的表达量达到峰值。构建重组载体进行Bm HMGS的原核表达并制备抗体后,采用Western blot技术在5龄1~7 d和上蔟1~3 d的蚕体翅原基、脂肪体中及上蔟1~3 d的生殖腺中都可以检测到Bm HMGS的表达,并且在翅原基中的表达没有发育时期特异性。研究结果表明,从20E诱导组的家蚕翅原基中鉴定的Bm HMGS与翅原基发育相关,其表达在5龄至上蔟阶段没有时期和组织的特异性,推测Bm HMGS是一个具有多种生物学功能的基因。     

家蚕对浓核病毒(镇江株)抵抗性和感受性品种的中肠组织蛋白比较分析

为了探明家蚕对浓核病毒(镇江株)抵抗性和感受性品种间在分子机制上的差异,通过蛋白质双向电泳(2-DE)和基质辅助质量飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)对两个不同抗性家蚕品种的中肠组织蛋白进行了比较分析。2-DE电泳结果表明,两个品种间的中肠组织蛋白斑点数及位置、形态等差异很小,进一步比较获得了9个差异蛋白斑点,其中感受性蚕品种JS有6个,抵抗性蚕品种NIL有3个。经MALDI-TOF MS鉴定结果显示,感受性品种JS有4个差异蛋白斑点可能分别为氢离子转运ATP合酶β亚基1、氢离子转运ATP合酶β亚基2、组织蛋白酶D或3-羟酰辅酶A脱氢酶;抵抗性品种NIL中有2个差异蛋白点可能是组织蛋白酶。     

家蚕近等基因系感染浓核病毒(BmDNV-Z)前后中肠组织蛋白的差异表达分析

家蚕浓核病毒(BmDNV)是危害家蚕的主要病毒之一。为鉴定与家蚕抗病毒相关的蛋白质,以对BmDNV完全不感染的家蚕品种兰10(L10)为供体亲本,将其抗性基因导入家蚕敏感品种菁松(JS)中,构建抗性近等基因系NIL(BC6F2)。对JS及其近等基因系NIL分别用家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)添毒,二者分别表现为高度敏感和完全不感染。对JS和NIL在病毒感染前后中肠组织蛋白双向电泳(2D-PAGE)图谱中的差异蛋白点进行串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析,共鉴定了41个差异表达的蛋白点,其中有35个蛋白点可能与病毒的诱导相关,有6个蛋白点可能与家蚕的组成抗性相关。鉴定的差异表达蛋白包括糖酵解酶类、能量代谢酶类、参与基因表达的蛋白质以及参与其它细胞功能的蛋白质等。选取10个差异表达蛋白点进行基因表达定量PCR分析,进一步确证了这些蛋白质在JS及其近等基因系NIL之间以及在病毒诱导前后的差异表达。例如:精氨酸激酶在NIL和JS中均可被诱导表达;V-ATP合成酶及热激蛋白HSP70只在NIL中被特异性诱导表达;烯醇化酶在NIL中的表达水平显著高于JS,且不能被病毒感染所诱导,是一个典型的组成抗性相关蛋白。鉴定出的41个差异表达蛋白点有可能参与了家蚕对BmDNV-Z的抗性。     

二化性家蚕卵低温和常温催青的胚胎期蛋白质表达差异分析

家蚕二化性品种的滞育性受上代胚胎期环境条件调控,查找家蚕胚胎期滞育关联蛋白,可为最终阐明家蚕滞育的分子机制提供实验依据。以家蚕二化性品种秋丰的蚕卵为材料,分别在25℃常温和18℃低温条件下催青,提取胚胎不同发育时期蚕卵的易溶性和难溶性蛋白,采用蛋白质双向电泳(2-DE)和图像分析技术,研究蚕卵在胚胎不同发育时期的蛋白质差异表达谱。在易溶性和难溶性蛋白图谱中分别检测到5个和7个差异显著的蛋白点。对这些差异蛋白点进行质谱鉴定,有8个蛋白点得到可信的最佳匹配蛋白报告,共鉴定出卵特异蛋白、卵黄原蛋白、表皮蛋白和丙酮酸脱氢酶激酶4种蛋白。这些差异表达蛋白可能导致蚕卵胚胎中物质代谢和能量代谢的不同,据此推测低温和常温催青可能在蚕卵胚胎中诱导了不同的生理生化反应。     

不同产丝量家蚕品系后部丝腺的蛋白质组学分析

家蚕幼虫后部丝腺是合成和分泌丝素蛋白的重要器官。为从蛋白质水平探究不同家蚕品系产丝量差异的原因,应用蛋白质组学研究方法,选取3个产丝量有较大差异的家蚕品系Ndx、大造和21-872为材料,通过双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对各品系5龄第5天幼虫后部丝腺表达的差异蛋白进行鉴定,查找与丝蛋白合成相关的蛋白质。结果表明,茧丝突变品系Ndx后部丝腺的蛋白质表达水平与普通丝量品系大造和高丝量品系21-872有差异,差异表达蛋白种类主要为应激反应相关蛋白、能量相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白和一些酶类,其中核糖体磷酸化蛋白P0和P2、蛋白质二硫化物异构酶、丝素轻链蛋白Fib-L以及丝素蛋白P25等在Ndx后部丝腺的含量明显低于其它2个品系。推测在茧丝突变品系Ndx的后部丝腺中,上述蛋白质表达量的变化可能是导致其不能正常吐丝结茧的原因。     

家蚕蜕皮激素22激酶2(BmEcK2)的序列及基因表达特征分析

前期研究发现在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,Bm CPV)的家蚕幼虫中肠中,有一个下调表达的差异蛋白可能参与了家蚕对Bm CPV感染的抵抗过程。利用Blastp进行同源性比对的结果显示,该蛋白质与尺蠖(Operophtera brumata)的未知蛋白质OBRU01_04785和蜕皮激素22激酶(Ecdysteroid 22-kinase)的序列相似度分别为51%、49%,进一步通过多序列比对和系统进化分析发现该蛋白质与Ecdysteroid 22-kinase蛋白的亲缘关系最近,属于蜕皮激素激酶超家族;该蛋白质与家蚕中已知的蜕皮激素22激酶1(Bm Ec K1)的序列相似度为24.4%,因此将其命名为Bm Ec K2。实时荧光定量PCR检测Bm Ec K2基因m RNA在家蚕5龄幼虫中肠组织中的转录水平最高,其次是马氏管、丝腺和卵巢,而在血淋巴、头部、精巢、脂肪体中几乎检测不到转录;家蚕5龄起蚕感染Bm CPV后24、48、72 h,中肠中Bm Ec K2基因m RNA的转录水平下调,分别是对照组家蚕中肠的0.32、0.45和0.21倍。研究结果初步提示,Bm CPV感染导致家蚕中肠中的Bm Ec K2下调表达,进而可能影响到家蚕体内激素调节水平的变化。     

家蚕5龄第3天幼虫头部组织蛋白质双向电泳及质谱鉴定

家蚕幼虫头部有单眼、触角、口器、脑等取食和感觉的中心器官及坚硬的外壳。提取家蚕5龄第3天幼虫头部组织蛋白质进行双向电泳,经银染检测到654个蛋白点,这些蛋白的分子质量主要分布在15～97 kD之间,等电点(pI)在4～8之间;在pH 3～4和9～10的区域,也有较多的蛋白质被检测到,但该区域高丰度的蛋白质数量较少。对丰度较高的100个蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,有52个蛋白质被鉴定,其中有21个酶类相关的蛋白,占被鉴定总蛋白质数的40.4%,其它蛋白质主要包括表皮蛋白、气味结合相关蛋白、肌肉相关蛋白等。研究结果可为家蚕幼虫头部组织的功能分析提供蛋白质水平的信息数据。     

家蚕孤雌生殖差异蛋白——热休克相关蛋白的生物信息学分析

应用双向凝胶电泳(2-DE)技术研究家蚕孤雌生殖蚁蚕和正常蚁蚕的总蛋白质的差异,得到与孤雌生殖相关的差异蛋白点,并对这些蛋白点进行基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF MS)分析,获得了相关差异蛋白的序列特征。将这些序列与已构建的家蚕cDNA文库及蛋白质数据库进行比对,得到3个差异蛋白为热休克相关蛋白。通过5-′RACE的方法克隆到3个差异蛋白的全基因序列,并对它们进行结构和特征分析,有助于进一步研究其与孤雌生殖的关系。     

雏鸡冷应激前后血清中差异蛋白质组学研究

本试验旨在比较分析雏鸡冷应激前后血清中蛋白质的表达差异,并对重点差异蛋白质进行鉴定。将30只雏鸡随机分为3组,分别为冷应激组、冷适应组和常温对照组,收集各组雏鸡的血液制备血清后进行双向凝胶电泳(2-DE),以获得血清蛋白质表达的2-DE图谱,对2-DE图谱进行差异分析(利用PDQuest 8.0软件),随后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对差异表达蛋白质进行鉴定,并利用蛋白质印迹(Western blot)方法进行验证。结果显示:通过2-DE对常温对照组、冷应激组和冷适应组雏鸡血清进行分析,得到了比较完整的差异蛋白质数据,共找到差异蛋白质点23个。采用MALDI-TOF-MS技术分析其中几个重复性好且较为明显的蛋白质点,成功鉴定出4个差异蛋白质,其中2个为果糖二磷酸醛缩酶C(ALDOC),是参与葡萄糖、能量代谢通路供能的相关蛋白;随后,对差异蛋白质ALDOC进行Western blot验证,所得结果与2-DE的结果相一致。结果表明,雏鸡冷应激前后血清中蛋白质的表达具有明显的差异,这些蛋白质的表达差异可能与冷应激有关。     

杀虫剂呋喃虫酰肼对家蚕的毒性试验

呋喃虫酰肼是具有类似蜕皮激素作用的昆虫生长调节剂类杀虫剂。为了明确呋喃虫酰肼用于大田害虫防治后对农业生态环境中家蚕安全性的影响,进行了该杀虫剂对家蚕的毒性试验。结果表明,50~1 000 mg/L呋喃虫酰肼药液对家蚕3龄幼虫无熏蒸毒性,但有一定触杀毒性和强烈的胃毒作用。采用食下毒叶法添食呋喃虫酰肼药剂,对2龄起蚕的48 h LC50值为142.095μg/L;对4龄起蚕6 h、24 h的LC50值分别为1.284 mg/L、0.274 mg/L;对5龄起蚕的6 h、24 h的LC50值分别为9.180 mg/L、1.431 mg/L。用LC10以下浓度的呋喃虫酰肼药液给3龄、4龄家蚕幼虫添食后,幼虫未出现蜕皮症状,熟蚕的上蔟时间也未改变。桑树喷洒100 mg/L呋喃虫酰肼药液至湿润,喷药后68 d时采摘桑叶连续24 h饲喂5龄起蚕仍会导致其全部中毒,头胸部出现与眠蚕相似的三角区,部分中毒幼虫的表皮剥落。由于呋喃虫酰肼对家蚕具有强烈的胃毒作用,且在桑叶中的残效期很长,因此该杀虫剂不能用于蚕区及周围的大田与森林害虫防治。     

家蚕胸腺素对蚕体抗核型多角体病毒感染能力的影响

胸腺素(THY)在动物进化过程中高度保守,并在许多生命活动中发挥重要作用。将家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)感染家蚕5龄幼虫后,分别提取蚕体及不同组织的RNA和蛋白质,检测Bm THY基因的转录及蛋白质表达的变化,并探究利用重组胸腺素r Bm THY增强家蚕抗病毒能力的可行性。qRT-PCR检测结果表明,感染Bm NPV后的家蚕5龄幼虫,其血淋巴、脂肪体、丝腺和气管中的Bm THY基因mRNA转录水平不同程度上调,而马氏管、中肠和头部组织中Bm THY基因mRNA转录水平则呈下调趋势;Western blotting检测家蚕5龄幼虫感染Bm NPV后72 h,蚕体内Bm THY蛋白的表达水平下降42.3%。家蚕5龄幼虫接种Bm NPV后,分别添食质量浓度为340μg/m L(高剂量)、34μg/m L(中剂量)和3.4μg/m L(低剂量)的r Bm THY溶液,调查3组幼虫的发病率为43.8%、54.0%和57.6%,而对照组幼虫分发病率为62.2%。研究结果初步证明Bm NPV感染可降低蚕体及部分组织中Bm THY的基因转录与蛋白质表达水平,高剂量r Bm THY添食处理可以在一定程度上提高家蚕抗Bm NPV病毒感染的能力。     

表皮蛋白BmCPR41在2龄不眠蚕突变体nm2中的表达和功能分析

家蚕(Bombyx mori)2龄不眠蚕(non-molting in the 2nd instar,nm2)突变体是从家蚕品种C603中发现的一种致死突变体,发育至2龄将眠期后不能正常入眠蜕皮,持续5～7 d后陆续死亡,图位克隆结果表明该突变体是由表皮蛋白BmCPG10突变引起的,且血淋巴中的蜕皮激素滴度显著低于野生型。蜕皮激素主要在前胸腺合成,因此本研究以nm2突变体和野生型家蚕2龄将眠蚕的前胸腺(包含第一对气管丛)为材料进行双向电泳分析,从中检测到一个表皮蛋白BmCPR41在突变体中的表达量高于野生型,组织表达谱表明BmCPR41在前胸腺的表达量远高于其他组织。通过RNAi敲低BmCPR41的表达,发现有部分家蚕推迟入眠或不入眠,蚕体重也显著低于对照组,且相关基因基于RNA-seq的表达情况与nm2突变体中的基本一致。基于上述实验结果推测BmCPR41基因在nm2突变体形成,尤其蜕皮激素信号通路上发挥重要作用。本研究结果为进一步研究nm2突变体的形成机制提供了实验证据,并可为研究蜕皮激素介导的信号通路提供理论依据。