核移植前激活牛受体卵子对供体核形态变化的影响

研究以牛体外受精卵作为供体、体外成熟卵子作为受体进行核移植。核移植后根据受体卵子的激活与否及细胞融合时间不同，分别观察了供体核在受体卵子内变化。     

不同培养体系对牛胚胎体外发育的影响

采用离子霉素和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)对牛体外成熟卵母细胞进行联合激活,激活后采用不同的培养体系进行体外培养,观察不同的培养液对牛孤雌激活胚体外发育能力的影响。3种培养体系分别为:A(0~48 h:CR1aa+3 mg/mL BSA;48 h~7 d:CR1aa+10%FBS),B(连续7 d均为SOFaa+3 mg/mL BSA),C(0~5 d:SOFaa+3 mg/mL BSA;6~7 d:SOFaa+10%FBS)。结果表明:3种培养液对卵裂率没有显著性影响,分别为87.22%,94.33%和91.30%,但囊胚发育率存在显著性差异,以A效果最好,其囊胚发育率为25.56%;C次之,囊胚发育率为11.80%;B最低,囊胚发育率为3.55%。之后选择最佳的培养液进行体外受精实验,结果表明CR1aa可用做牛胚胎体外生产的培养液。     

体外成熟培养20～22h牛卵母细胞激活及孤雌发育的研究

本研究将体外成熟培养 2 0～ 2 2h的牛卵母细胞 ,用Ca2 + 上升因子单一激活或组合Ca2 + 上升因子和蛋白质抑制因子激活 ,其结果单一激活的卵子激活率在 19.2 %～ 2 8.0 % ,复合激活的卵子激活率在 84 .2 %～ 86 .8%。单一激活组的卵子激活率显著高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,复合激活组的卵子激活率显著高于单一激活组 (P <0 .0 1) ,而单一激活组之间和复合激活组之间无显著差异 (P >0 .0 5 )。复合激活组的卵裂率及孤雌发育都显著高于对照组。     

无血清培养液对牛腔前卵泡体外发育的影响

本文研究了基础培养液中不添加犊牛血清(FCS)及添加不同比例FCS对牛腔前卵泡体外发育和激素分泌的影响。结果显示:添加FCS对腔前卵泡体外生长无明显促进作用,对腔前卵泡的体外发育、存活及激素分泌也影响不大。腔前卵泡在无血清条件下可持续生长、分泌性腺激素。     

核移植中卵母细胞激活方法的研究进展

核移植后的重构胚,只有卵母细胞质被激活后才能启动发育,低的核移植胚发育率可能与卵母细胞质未充分激活有关。对核移植中卵母细胞激活方法进行了综述。对常用的几种激活方法及其激活原理进行了介绍。     

添加不同发情时期山羊血清对牛胚胎体外发育的影响

为了提高牛体外胚胎囊胚发育率,添加不同发情时期山羊血清对牛胚胎进行体外培养。分别采集发情周期D0、D2、D4和D7山羊血清（发情当天为D0）,灭活除菌备用。结果表明不同发情时期羊血清对孤紫激活胚胎孵裂率影响差异不显著,囊胚发育率分别为29.5%、32.4%、33.9%和41.3%,D7血清能显著提高囊胚发育率（P＜0.05）,且扩张和孵化胚出现较早。添加D0血清体外受精胚胎卵裂率较高,但对囊胚发育率影响差异不显著。说明孤紫激活和体外受精胚胎发育有差异,D7血清对胚胎后期发育有利。受精胚无血清培养3d后添加D7血清,囊胚发育率为42.9%,是较为理想的培养方法。     

供体细胞的不同处理方法对牛核移植重构胚发育能力的影响

为了研究供体细胞不同的处理方法对核移植重构胚的作用，比较了用于保种的冻存和新鲜的成纤维细胞做供体细胞、供体细胞不同的离心转数、供体细胞不同的血清饥饿时间及用本实验室冻存的成纤维细胞，解冻复苏后，不同传代次数对重构胚的影响。结果表明分别用冷冻保存的和新鲜的成纤维细胞作为核供体，所得重构胚卵裂率、囊胚率无显著差（P>0.05）；供体细胞离心800 r/min时所得重构胚效果较好，离心1500 r/min所得重构胚的卵裂率、囊胚率与其他3组相比较低；血清饥饿3～5 d组所得重构胚比其他3组好；用解冻复苏后再传2、5代的细胞进行核移植，所得重构胚的卵裂率、囊胚率无明显差异(P>0.05)，显著高于传8代的细胞所得重构胚。说明供体细胞的不同处理方法对核移植重构胚发育有很重要的影响。     

体外成熟对牛卵母细胞孤雌激活后发育潜力的影响

本试验在卵母细胞体外成熟的研究基础上,研究了培养用水、卵泡液和成熟时间对卵母细胞体外成熟及孤雌激活后发育潜力的影响.结果表明(1)将卵母细胞分别于蒸馏水和Milli-Q超纯水配制的成熟培养液中培养22～24 h, 孤雌激活后, 卵裂率无显著差异(P>0.05); 但孤雌卵在超纯水配制的胚胎培养液中培养,囊胚发育率为22.3%, 明显高于在蒸馏水配制的培养液中的囊胚发育率14.1%(P<0.05).(2)在成熟培养液中添加10%、20%卵泡液,成熟卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(32.3%, 30.9%)明显高于添加5%和0%卵泡液组的囊胚发育率(21.8%, 22.7%,P<0.05).卵母细胞在添加20%卵泡液的培养液中成熟培养,孤雌激活后囊胚孵化率明显低于添加0、5%、10%卵泡液组的囊胚孵化率(P<0.05).(3)成熟28 h或30 h的卵母细胞孤雌激活后,其囊胚发育率(30.5%或29.4%)明显高于成熟24 h或26 h组的囊胚发育率(20.5%或22.1%,P<0.05).     

电激活对完全体外化牛细胞核移植的影响

牛卵母细胞在体外成熟２３～２４ｈ时去核，去核卵用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ两次电脉冲激活（Ⅰ组）或不激活（Ⅱ组），然后将体外受精、发育的８～３２细胞期胚胎的单个卵裂球注入卵周隙，用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ两次电脉冲诱导卵裂球与去核卵母细胞融合。Ⅰ组操作后存活率和融合率（８８．４％和５５．０％）显著低于Ⅱ组（９５．９％和６５．１％，Ｐ＜０．０５）。融合卵体外培养２４ｈ和５～８ｄ后，Ⅰ组核移植胚胎的卵裂率和桑椹／囊胚发育率（６３．０％和１５．２％）与Ⅱ组（５０．５％和７．８％）无显著差异，但Ⅰ组结果均好于Ⅱ组。将来自两组的２５枚桑椹和囊胚移植到１６头同期受体，在已检查过的８头受体中２头受体妊娠，其中１头于妊娠后４个多月流产，１头于妊娠期满后产出一雄性牛犊。研究结果表明：去核卵母细胞的电激活尽管对重组卵的存活与融合不利，但可改善核移植胚的卵裂和发育。本研究在我国首次获得牛细胞核移植的成功，证明用ＩＶＭ卵母细胞和ＩＶＦ胚胎进行完全体外化的牛细胞核移植是可行的。     

不同成熟培养体系对绵羔羊卵子体外成熟和受精胚发育的影响

本研究探讨两种常用的绵羊卵子体外成熟液对绵羔羊卵子体外成熟、受精和胚胎发育能力的影响,以期为改善绵羊JIVET技术体系提供借鉴。在绵羔羊卵子体外成熟方面,体外培养18 h后II液组卵子不但存活率显著高于I液组(0.82±0.02 vs 0.72±0.03,P<0.05),而且卵子成熟率也显著高于I液组(0.63±0.02 vs 0.57±0.04,P<0.05);受精后胚胎发育方面,I液和II液组的卵裂率差异不显著(0.79±0.02 vs 0.81±0.02,P>0.05);然而II液组桑葚胚率显著高于I液组(0.71±0.02 vs 0.65±0.03,P<0.05)。总之,II液对绵羔羊卵子体外成熟、受精及发育的支持能力较好。此外,本研究进一步指出,II液中的半胱酰胺和丙酮酸钠可能是使其具有较强支持绵羔羊卵子成熟、发育能力的主要原因。     

供体细胞和去核卵母细胞的不同预激活对体细胞核移植胚胎体外发育的影响

研究用细胞质内注射法构建重组胚，比较了离子霉素和乙醇预激活供体细胞和去核卵母细胞对重组胚卵裂和体外发育的影响。结果表明：与未经处理的对照组相比，离子霉素预激活供体细胞对重组胚的卵裂率和囊胚发育率有所提高；而供体细胞和去核卵母细胞同时用离子霉素预激活，重组胚的卵裂率无明显提高，囊胚发育率下降；用离子霉素或乙醇预激活去核卵母细胞，对重组胚的卵裂和发育无明显影响。     

供体核和受体胞质在核移植重构胚重编程中的研究进展

供体核和受体胞质是影响核移植重构胚重编程的主要因素.文章讨论了供体细胞中的成熟促进因子、形态、核仁结构、组蛋白变化及其DNA甲基化和受体胞质在核移植重构胚重编程中的作用,并且综述了几种促进核移植重编程的方法.     

Factors Affecting the Development of Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos in Cattle

Nuclear transfer is a complex multistep procedure that includes oocyte maturation, cell cycle synchronization of donor cells, enucleation, cell fusion, oocyte activation and embryo culture. Therefore, many factors are believed to contribute to the success of embryo development following nuclear transfer. Numerous attempts to improve cloning efficiency have been conducted since the birth of the first sheep by somatic cell nuclear transfer. However, the efficiency of somatic cell cloning has remained low, and applications have been limited. In this review, we discuss some of the factors that affect the developmental ability of somatic cell nuclear transfer embryos in cattle.     

牛早期胚胎体外发育条件的研究

本试验研究了精卵共育时间和培养液等因素对牛早期胚胎体外发育的影响。精卵共育6～12h能显著提高受精卵的囊胚发育率,受精卵的囊胚发育率为23．2％～25．3％,共育时间为24h时,囊胚发育率降低,但精卵共育6h时卵裂率较低;TCM199、mBECMaa、mSOFaa均能支持体外受精卵的发育,其囊胚发育率分别为18％、30．7％和29．2％。试验结果表明：精卵于BM受精液中共育9h后,将其置于添加5％OCS的mBECMaa或mSOFaa中培养,能得到较高的体外生产胚胎的囊胚发育率。     

酒泉地区不同受体牛胚胎移植效果观察

本试验对酒泉地区不同品种、年龄、胎次、体况受体牛的胚胎移植效果进行了分析研究.结果发现,移植妊娠率为：西杂受体牛（52.42％）＞土杂受体牛（47.78％）＞中国荷斯坦受体牛（46.94％）;2～6周岁的受体牛移植妊娠率（51.94％）高于7岁以上的受体牛（40.56％）;经产1～3胎受体牛移植妊娠率（51.61％）高于4胎以上牛（51.28％）和育成牛（47.06％）;体况上等受体牛的移植妊娠率（52.31％）高于体况中等受体牛（48.87％）.其中除2～6周岁与7岁以上受体牛的移植妊娠率差异极显著外（P＜0.01）,其余均差异不显著（P＞0.05）.     

免胚胎细胞核移植重组胚的发育力

以兔为模型 ,对影响胚胎细胞核移植重组胚发育力的电融合与激活参数、体外培养系统进行了探索性研究。结果表明 ,有利于重组胚发育力的适宜电融合与激活参数为 2 0 0 V/ m m的电场强度、10 0μs的脉冲宽度 ;在不同的体外培养系统中 ,TCM- 199培养液内于兔胎儿成纤维细胞饲养层 (REF feeder)上共同培养的重组胚获得了最高的 2～ 4-细胞发育率和桑椹胚或囊胚的发育率 ,分别为 6 5 .7%和 2 2 .9%;移植 111枚重组胚给 9只假孕母兔 ,其中 2只妊娠 ,1只完成足月妊娠产出 2只克隆仔兔 ,另 1只在妊娠 2 2 d流产 1只克隆死胎。     

A Cathepsin B Inhibitor,E-64, Improves the Preimplantation Development of Bovine Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos

Bovine somatic cell nuclear transfer (SCNT) is an important and powerful tool for basic research and biomedical and agricultural applications, however, the efficiency of SCNT has remained extremely low. In this study, we investigated the effects of cathepsin B inhibitor (E-64) supplementation of culture medium on in vitro development of bovine SCNT embryos. We initially used three concentrations of E-64 (0.1, 0.5, 1.0 μm), among which 0.5 μm resulted in the highest rate of blastocysts production after in vitro fertilization (IVF), and was therefore used for further experiments. Blastocyst development of SCNT embryos in the E-64 treatment group also increased relative to the control. Moreover, the cryosurvival rates of IVF and SCNT blastocysts were increased in E-64 treatment groups when compared with the control. On the other hand, we found that IVF and SCNT blastocysts derived from E-64-treated groups had increased total cell numbers and decreased apoptotic nuclei. Furthermore, assessment of the expression of apoptosis-related genes (Bax and Bcl-xL) in bovine IVF and SCNT blastocysts treated with E-64 by real-time RT-PCR analysis revealed suppressed expression of the pro-apoptotic gene Bax and stimulated expression of the anti-apoptotic gene Bcl-xL. Taken together, these finding indicate that addition of E-64 to embryo culture medium may have important implications for improving developmental competence and preimplantation quality in bovine IVF and SCNT embryos.